【摘要】目的研究生长抑制DNA损伤基因(growth arrest and DNA damage, gadd)对卵巢癌细胞生长抑制和凋亡的作用。方法RT-PCR鉴定卵巢癌SKOV3和3AO细胞株gadd153基因表达。通过目的基因的克隆、载体构建技术，将目的基因gadd153重组于plXSN-neo逆转录病毒表达载体；构建的pLXSN-gadd153载体采用脂质体(lipofectin)(DOTAP)的方法，分别转染SKOV3和3AO细胞株；经G418抗性筛选；RT-PCR表达鉴定；足叶乙甙(VP16)诱导，采用流式细胞仪分析(FCM)的方法检测转染前后肿瘤细胞的生长抑制和凋亡。结果SKOV3-gadd153细胞生长抑制在G1／G0期，部分细胞进入凋亡的状态；3AO-gadd153细胞生长抑制，未引起凋亡。结论转染gadd153基因的肿瘤细胞系，诱 导表达后可诱发肿瘤细胞生长抑制在G1／G0期，并有细胞进入凋亡状态。证实gadd153基因参与了细胞生长抑制和凋亡过程。

THE STUDY OF EFFECTS OF gadd153 GENES ON CELL GROWTH

AND APOPTOSIS OF OVARIAN CANCER CELL IN VITRO

Zhou Zhichun, Feng Jie^Δ, Qian Henian, Wang Shenwu^*, Cui Heng, Fu Tianyun, Yexue

(Gynecologic Oncology Center,^*The Central Laboratory, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing)

【Abstract】Objective To study the effects of growth arrest and DNA damage(gadd) genes on the growth and apoptosis in ovarian cancer cell lines.MethodsWe constructed a retrovirus(pLXSN-gadd153)which was transfected into SKOV3 and 3AO with lipofectin (DOTAP),respectively, then screened by anti-G418 and identified the expression of gadd153 genes by RT-PCR. Apoptosis was analyzed using FCM and DNA ladder.ResultsGrowth inhibition and the apoptosis were observed in the SKOV3 cells transferred with gadd153 genes and also in the 3AO cells transferred with the same genes but there was only growth inhibition with no apoptosis occured.ConclusionsThe expression of gadd153 could make tumor cells arrested in G1／G0 and apoptosis could be developed in some other cell lines.

【Key words】 gadd153 genes; Ovarian cancer cell lines; Growth inhibition; Apoptosis

卵巢恶性肿瘤死亡率居妇科恶性肿瘤首位。肿瘤细胞群体的一大特征是细胞增殖与分化平衡失调，这一调节过程有许多癌基因、抑癌基因的参与。许多文献报道了有关与细胞分化和凋亡的基因，为探索肿瘤发生奠定了基础。我们就gadd153基因对卵巢癌细胞株的作用进行了初步研究。

材料和方法

1. 材料

1.1细胞株：SKOV3为卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株，来源于美国Memorial Sloan-Kettering Cancer Center;3AO为卵巢上皮癌细胞株，来源于上海中国科学院细胞库。

1.2目的基因、质粒和菌株：gadd153的目的基因、plXSN逆转录病毒表达载体、大肠杆菌DH5-α均由人民医院中心实验室王申五教授惠赠。

1.3试剂：内切酶、T4连接酶及G418均为Sigma产品，Lipofectin (DOTAP)购自Boehringer Mann-heim公司；RNA及RT-PCR试剂盒购自同正公司。

2. 方法

2.1质粒构建、鉴定、纯化：plXSN-neo逆转录病毒表达载体经BamH-1酶切(使其成为线性)，T4连接酶将目的基因gadd153(BamH-Ⅰ单酶切后回收)连接于plXSN-neo载体。重组质粒为plXSN-gadd153，转化大肠杆菌DH5-α，提取质粒酶切鉴定 重组，PCR鉴定方向；PEG8 000纯化。

2.2细胞转染及筛选：采用Lipofectin(DOT-AP)方法.将plXSN-gadd153重组质粒分别转染SKOV3和3AO细胞株，5%CO₂，37℃培养箱培养。而以空载体pLSXN-neo分别转染上述细胞株为阴性对照；亲本SKOV3和3AO细胞株为空白对照。

根据真核质粒有G418抗性，用G418进行筛选培养。从高浓度(600 mg/L)开始，当对照组细胞大部分死亡，G418的浓度降低一半(300 mg/L)，维持筛选，待长出单克隆后，扩大培养。

2.3G418筛选后的细胞鉴定：根据gadd153基因全序列，设计上下游引物：S:5′-AGCTGGAAGCCTGGTATGAG-3′ SA:5′-GACCACTCTGTTT-CCGTTTC-3′ RT-PCR内参引物为(β-actin)： S：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′ SA：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′

提取细胞RNA，按试剂盒说明进行RT-PCR。

2.4细胞诱导的条件：用不同浓度的足叶已甙(Vp16)诱导亲本卵巢癌细胞株SKOV3和3AO、培养不同时间，经RT-PCR测定gadd153基因的表达。

同样的条件诱导实验组、阴性对照组及空白对照组细胞，进行细胞生长抑制和凋亡指标的测定。

Vp16浓度(mg/L)：10、20、40、80、160、320、640，培养时间(h)：12、16、20、24、28、32、36优化的最佳条件：浓度(mg/L)：80、160，培养时间：24h。

2.5细胞凋亡测定：碘化丙啶(PI)荧光染色流式细胞仪(FCM)分析细胞凋亡^［1］。

DNA“ladder”测定：收集约5×10⁶待检细胞，用细胞裂解液(1%NP40、20mmol/L EDTA pH8.0、50mmol/L Tris. HClpH7.5)裂解，蛋白酶K消化(1g/L)，提取DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳(80V，约2～3 h)后观察结果。

结果

1. 经Vp16诱导的卵巢癌SKOV3和3AO细胞株，RT-PCR的鉴定结果：无gadd153基因产物表达；转染外源性gadd153基因的卵巢癌细胞株SKOV3和3AO，Vp16诱导后gadd153基因表达阳性(图1)。

图1

1经UV诱导的SKOV3-gadd153、3AO-gadd153、SKOV3、3AO细胞RT-PCR鉴定结果。 1.SKOV3-gadd153细胞RT-PCR产物可见在1.0kb处有1条带2.3AO-gadd153细胞RT-PCR产物可见在1.0kb处有1条带3.SKOV3细胞RT-PCR产物未见条带4.3AO细胞RT-PCR产物未见条带M.PBR322／BSTN-Ⅰ marker

Fig.1Identify of various cells by PT-PCR.1.SKOV3-gadd153 cell；2.3AO-gadd153 cell;3.SKOV3 cell;4.3AO cell;M,PBR322／BSTN-1 marker.

2. 质粒pLXSN-gadd153构建结果，BamH-Ⅰ内切酶消化及PCR鉴定为正向连接(图2)。

图2

2pLXSN-gadd153酶切鉴定结果。1.pLXSN-gadd153经BamH-Ⅰ酶切产物可见在1.0kb处有1条带 2.pLXSN-gadd153重组质粒3.pLXSN-neo原质粒M.PBR322／BSTN-Ⅰ marker

Fig. 2 Identify of plXSN-gadd153 digested by Enzymes.1. pLXSN-gadd153 digested by BamH-Ⅰ;2. pLXSN-gadd153 recombinant;3. pLXSN-neo plasmid;M,PBR322／BSTN-1 marker.

3.转染gadd153基因的SKOV3和3AO阳性细胞株，经Vp16诱导后，FCM分析SKOV3-gadd153细胞株可出现G1期的延长，有细胞凋亡峰出现(图3A，3B)；但是亲本SKOV3细胞和SKOV3-pLXSN细胞未出现上述表现(图3C，图3D)。3AO-gadd153细胞株只出现G1期的延长(图4A)；而亲本3AO细胞和3AO-pLXSN细胞未出现上述表现(图4B，图4C)。

图3Vp16诱导SKOV3-gadd153、SKOV3-pLXSN、SKOV3细胞经流式细胞仪分析结果

A.Vp16诱导SKOV3-gadd153细胞G1期延长细胞生长抑制B.Vp16诱导SKOV3-gadd153细胞出现凋亡峰C.Vp16诱导SKOV3-pLXSN细胞无G1期延长及凋亡峰D.Vp16诱导亲本SKOV3细胞无G1期延长及凋亡峰

Fig.3 DNA cell-cycle analysis of SKOV3 cell by FCM.

A，growth inhibition and G1 prolongation of SKOV3-gadd153 cell.B，Apoptosis of SKOV3-gadd153 cell.C，Neither growth inhibition，nor apoptosis of SKOV3-pLXSN cell.D，Neither growth inhibition, nor apoptosis of SKOV3 cell.

图4Vp16诱导3AO-gadd153、3AO-pLXSN、3AO细胞经流式细胞仪分析结果

A.Vp16诱导3AO-gadd153细胞G1期延长B.Vp16诱导3AO-pLXSN细胞无G1期延长C.Vp16诱导亲本3AO细胞无G1期延长

Fig.4 DNA cell-cycle analysis of 3AO cell by FCM.

A,