【摘要】目的为探讨葡萄糖调节蛋白94(GRP94)在胚胎发育中的作用，研究了10～31周人胎组织GRP94的定位及表达。方法用SP免疫组织化学方法。结果结肠粘膜上皮、肾小管上皮及肝细胞的胞质内，在10周已有GRP94的表达，18～20周时表达增多，一直维持较高水平。胃粘膜上皮及心肌细胞也有较强的表达。肺、骨骼肌、脊髓及胸腺未见表达。结论GRP94存在着基础表达，可能在某些器官的发育过程中起作用。

STUDY ON THE EXPRESSION OF GLUCOSE－REGULATED PROTEIN94

IN DEVELOPMENT OF THE HUMAN FETUSES

Wu Yidi， Song Jindan^Δ

(Institute of Medical Molecular Biology,China Medical University; Key Laboratory of Cell Biology,

Ministry of Public Health of China, China Medical University,Shenyang)

【Abstract】 Objective Glucose－regulated protein94(GRP94),which belongs to HSP90 family, is resided to the endoplasmic reticulum(ER) as molecular chaperones. We examined the distribution of GRP94 development human embryonic organs.Method 9 human fetuses(weeks 10－31 of gestation)were studied by immunohistochemistry.Results The expression of GRP94 had been shown in the epithelial cells of colonic mucosa,renal tubule and hepatocytes,localized in the cytoplasma of the cells.GRP94 was observed at gestational week 10,increased markedly from 18－20 week and maintained at constantly high level.It was also detected in the gastric mucosa and cardiac muscle.No GRP94 expression was shown in lung、skeletal muscle、spinal cord and thymus.Conclusions GRP94 is constitutively expressed within specific tissues and suggest that GRP94 might play an important role in the embryogenesis.

【Key words】 Glucose－regulated protein 94; Heat shock protein; Embryogenesis

葡萄糖调节蛋白(glucose－regulated proteins,GRP94)是一类应激蛋白，与热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)有较高的同源性，其中常见的GRP94和GRP78位于内质网腔，作为分子伴侣协助蛋白质的正确折叠和装配。特别是GRP94由内质网合成，为驻留于内质网腔的内质网标志分子伴侣，具有多种重要的生物学功能^［1，2］。最新研究发现，GRP94在小鼠心脏的器官发生中有作用^［3］。迄今，有关HSPs对胚胎发育的作用已有大量研究，但对GRPs的了解却很少，特别是在人胎中的有关研究国内外未见报道。鉴于此，我们应用免疫组织化学方法，探讨了GRP94在胚胎组织中的表达及定位。

材料和方法

1. 材料

9例胎儿标本来源于难免流产及子宫肌瘤合并妊娠行“子宫切除术”获得的胎儿。根据停经时间、B超胎儿双顶径及胎儿顶臀长度确定胎龄，分别为10、11、12、18(n=2)、20、28、29⁺⁴、31⁺²周，按胎龄分为发育早期(10～12周)、中期(18～20周)和晚期(28～31⁺²周)进行分组观察。

2. 试剂

GRP94单抗为鼠抗鸡输卵管GRP94的抗体(Ig2α)，美国ABR公司产品。广谱SP免疫组织化学试剂盒为福州迈新公司产品，生物素标记的第二抗体适用于鼠和大鼠来源的单抗以及兔来源的多抗。DAB为Sigma公司产品。

3. 方法

迅速剖取胎儿组织(结肠、肾、肝、胃、肺、心肌、骨骼肌、脊髓及胸腺)固定于10%福尔马林中，石蜡包埋，连续石蜡切片(5μm)，置于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，用于HE染色及SP法免疫组织化学染色(同时设立不加一抗的阴性对照)。

染色过程如下：切片常规脱蜡至水化。组织抗原微波修复，于0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH7.6)中，微波炉加热至微沸并持续5～10min。用3%H₂O₂室温孵育10min，封闭内源性过氧化物酶；10%非免疫动物血清，37℃，30min以阻断非特异性反应。加第一抗体(GRP94抗体，工作浓度为1∶400)37℃孵育2h，加生物素标记的第二抗体，37℃，30min，最后加链霉亲合素－过氧化物酶复合物，37℃，20min(各步间需0.1mol/L PBS漂洗)，经H₂O₂－DAB呈色(100ml 50mmol/L Tris－HCl(pH7.4)缓冲液中含DAB 50mg、H₂O₂33μl)3～7min。苏木素复染、脱水、透明及封片。

4. 判定标准

GRP94主要表达在细胞质内，呈棕黄色颗粒。由于结肠、肾及肝结构不同，选择不同的判断标准：每片随机观察5个视野，按平均每个视野阳性反应面积占所观察的结肠粘膜面积或肾小管面积或肝视野面积的百分比，计：＜30%为“+”，30%～60%为“++”，＞60%为“+++”。

结果

1. 结肠

10～12周：结肠粘膜单层柱状上皮及肠腺上皮细胞质内出现较多的棕黄色颗粒(+/++)，其他部位未见着色(图1)。18～20周：肠腺明显，杯状细胞数量增多。结肠粘膜上皮及肠腺上皮细胞质内棕黄色颗粒明显增多，主要位于细胞的基底部(+++)(图2)。28～31⁺²周：肠上皮细胞呈现较多的棕黄色颗粒，肠腺上皮细胞表达更为明显(+++)(图3)。

阴性对照：结肠粘膜无棕黄色颗粒出现，为阴性(-)(图4)。

2. 肾皮质

10～12周：阳性颗粒定位于肾小管上皮细胞质内，主要靠近管腔面的胞质内分布，数量较少(+)(图5)。18～20周：肾皮质中可见数量较多的肾小球及已分化的各种肾小管，阳性颗粒存在于肾小管上皮细胞中，以近端小管为主，阳性物质明显增多(+++)(图6)。28～31⁺²周：肾皮质进一步发育成熟，肾小体丰富，肾小管上皮细胞内仍然出现较多的棕黄色颗粒(+++)(图7)。

阴性对照：肾皮质中无棕黄色颗粒，为阴性(-)(图8)。

3. 肝

10～12周：靠近中央静脉处的一些肝细胞内出现棕黄色颗粒，核周分布明显。颗粒数量较少(+)(图9)。18～20周：肝细胞的胞质内，尤其是核周区呈现较多的棕黄色颗粒，肝小叶内带的肝细胞阳性细胞多于中、外带的肝细胞(++)(图10)。28～31⁺²周：阳性颗粒明显增加，肝小叶内带的肝细胞表达高于中、外带的肝细胞(++/+++)(图11)。

阴性对照：肝细胞中无棕黄色颗粒(-)(图12)。

4. 胃

(胃体部，20周)：胃粘膜上皮及腺体上皮细胞质内有棕黄色物质，表达量较多(++)，其他部位未见阳性颗粒。

5. 心肌

(20周)：心肌细胞质内有较强的表达(+++)。

肺、骨骼肌、脊髓及胸腺均未见表达。

讨论

细胞在各种应激因子作用时能产生热休克蛋白，在非应激状态下，细胞内也有相当量的热休克蛋白的表达，这提示热休克蛋白在细胞内很可能发挥重要作用^［4］。许多研究表明，胚胎发育期，在细胞分化、生长、发育过程中表达多种热休克蛋白，其表达并无固定模式，但具有时间顺序性和组织特异性，推测热休克蛋白可能有特定的功能。据文献报道HSP90及HSC70(heat shock cognates,HSC)在植入前的小鼠胚胎中有表达^［5］。HSP84和HSP86在8.5d小鼠胚胎中均为高表达，HSP84在小鼠所有组织中都表达，而HSP86则在睾丸中表达高并局现于生殖细胞中，认为HSP86在精子发生中起作用^［6］。Hatayama研究发现^［7］，HSP105在9～11d小鼠胚胎中表达较高，提示HSP105在小鼠胚胎器官发生中有作用。Tanaka等^［8］运用原位杂交较为详细地研究了眼的器官形成过程中不同HSP(HSP32、HSP60、HSP70、HSP84、HSP86)的表达，发现HSP表达的类型、时间、部位随胚胎发育过程而不同。

GRPs也是一种应激蛋白，与HSPs有较高的同源性，如GRP94、GRP78与HSP90、HSP70的同源性分别为50%和60%。研究表明，GRPs存在着基础表达，作为分子伴侣在体内发挥重要的生物学功能。最近，Barnes等^［3］报道在小鼠心脏发育过程中，GRP94的表达定位于心脏原基的外胚层表面及神经管。9.5～12.5d的小鼠胚胎表达高，晚期表达下降，提示GRP94可能与小鼠的心脏发育有关。我们研究了GRP94在10～31周人胚不同器官中的表达。结果表明：结肠粘膜上皮、肾小管上皮及肝细胞在10周已经表达GRP94，18～20周表达增多，并维持较高水平。胃粘膜上皮及心肌细胞在20周也有较强的表达。肺、骨骼肌、脊髓及胸腺组织未见表达。上述各胚胎组织除心肌组织外，GRP94的表达以上皮细胞为主，核周或基底部表达多，与细胞超微结构中内质网结构的分布比较一致。内质网膜系统在蛋白质合成及物质运输过程中起重要作用，其发达程度被看作是细胞分化和功能旺盛的表现特征。本研究中，胚胎早期的结肠、肾、肝(10～12周)已有GRP94的表达，但数量较少，可能是正处于发育时期细胞尚未发育<