【摘要】目的探讨镉对大鼠附睾体部的超微结构影响及其作用机理。方法单纯小剂量氯化镉(2 mg/kg体重)及加锌腹腔内注射后，用透射电镜及硫胺素焦磷酸酶(TPPase)电镜细胞化学定量分析。结果镉注射后4h，主细胞出现轻度超微结构损伤；24h至3d进一步加重；7～15d退变最严重；30～60d基本恢复。TPPase反应产物4h后明显减少，3d后暂时回复，但7～15d再次下降，60d恢复正常。锌保护各组主细胞形态正常，TPPase反应产物较单纯镉组量多，至15d达正常水平。结论镉对大鼠附睾体部的损伤较轻；镉对主细胞TPPase活性的影响比对结构的损伤敏感些；早期损伤系镉的直接毒理作用，后期则由于雄激素水平下降加重损伤。

THE INJURIOUS EFFECTS OF CADMIUM ON EPIDIDYMAL

CORPUS AND THE PROTECTIVE EFFECTS

OF ZINC IN RATS

Xu Chen^Δ Li Weixin

(Laboratory of Electron Microscopy,Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing)

【Abstract】 Objective Investigating the effects of cadmium(Cd) on the ultrastructural changes of epididymal corpus and the protective effects of zinc.Methods The animals were injected with small dose of CdCl-2(2mg/kg body weight) and Cd+Zn.The specimens were studied with transmission electron microscope and quantitative analysis of thiamine pyrophosphatase(TPPase) cytochemistry.Results The injures of principal cells could be detected after 4 hours of Cd treatment and became more serious within 24 hours to 3 days.The degeneration was most prominent within 7～15days, but tended to alleviate after 30～60 days.The TPPase reactive product was reduced markedly on the day 4 after Cd treated.There was a temporary recovery of the TPPase reactive product on day 3 but decreased again within 7～15 days.After 60 days of Cd treatment,the TPPase reactive product returned to normal.The morphology of principal cells of Zn protected groups was almost normal,and the quantity of TPPase reactive product was more than that of Cd treated groups at the same time.On day 15,it returned to normal.Conclusions The injurious effects of cadmium on epididymal corpus were milder;The effects of cadmium on the TPPase activity were more sensitive than the morphological alterations;The earlier damage of epididymal corpus was related to the direct action of cadmium;The decrease of androgen at the later stages might accelerate the degeneration.

【Key words】 Cadmium; Zinc; TPPase; Ultrastructure; Epididymis; Rat

附睾在超微结构及功能上存在区域性差异。文献报道镉对附睾损伤的研究集中于附睾头部，多为光镜及生化功能分析方面。有关对血管影响超微结构研究也有报道，有学者认为镉对睾丸及附睾头部的血管亲和性强，而对体、尾部血管不敏感^［1］。我室曾报道镉能迅速导致大鼠附睾头部超微结构损伤，锌则有明显的保护作用^［2］。有关镉对附睾体部上皮及其管周组织损伤和锌保护作用的超微结构研究尚未见有报道。大鼠附睾体部是以分泌功能为主，其主细胞的高尔基复合体很发达，硫胺素焦磷酸酶(TPPase)是高尔基复合体的标志酶。近年来生化研究表明，附睾体部的分泌物与精子运动有密切的关系^［3］。我们用超微结构观察、TPPase电镜细胞化学定量分析等方法，探讨镉对大鼠附睾体部的超微结构损伤和锌的保护作用机制。

材料和方法

1. 动物分组

成年健康雄性Wistar大鼠48只，体重250～325g，分为实验组和对照组。实验组共36只动物，分为单纯镉组及镉加锌组，每组3只。单纯镉组按2 mg/kg体重剂量，腹腔内一次性注射0.1%氯化镉(生理盐水配制)，分别于注射后1、4、24h及3、7、15、30、60d取材；镉加锌组分3次注射：先注射1%醋酸锌15 mg/kg体重，2h后注射氯化镉(剂量同上)和醋酸锌50 mg/kg体重，再间隔2h注射醋酸锌15 mg/kg，醋酸锌总剂量为80 mg/kg体重，上述处理后1、3、7、15d取材。对照组大鼠每时间段1只，共计12只，腹腔内注射等量生理盐水。上述氯化镉及醋酸锌的注射剂量和方法参照Saksena等^［4］报道。以上各组均作常规电镜超微结构及有关电镜细胞化学观察。

2. 常规电镜样品制备

根据Hermo的大鼠附睾分段法^［5］，取右侧附睾体部小块组织，用磷酸缓冲液配制的4%戊二醛作预固定2h，1%四氧化锇作后固定2h(pH7．2～7.4)，酒精及丙酮逐级脱水，环氧树脂618浸透包埋。先制作1 μm半薄切片，经1%次甲基蓝-天青Ⅱ染色后定位，再制备超薄切片，经醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，H-600型透射电镜观察。

3. 硫胺素焦磷酸酶(TPPase)电镜细胞化学样品制备

切取左侧附睾体部小块组织，2%戊二醛浸泡固定，制备100 μm切片，置入孵育液^［6］(主要含硫胺素焦磷酸，氯化锰，硝酸铅等)，37℃孵育1h。对照组孵育液中无硫胺素焦磷酸。经上述处理后，再按常规电镜样品制备，超薄切片，不经铅染色。

4. 附睾体部上皮主细胞TPPase反应产物图像分析

电镜下放大20 000倍，随机拍摄各组动物附睾上皮主细胞核上区高尔基复合体内TPPase反应产物，每组拍摄10张，共计130张照片。运用TECBIAS-6803真彩色医学图像分析系统对所得照片上的TPPase反应产物总目标面积与背景(胞质)面积比值(TA/BA)进行测量。

所有实验数据均以平均值±标准差(±s)表示，统计方法采用方差分析，并作多组比较，微机自动处理。

结果

1. 超微结构变化

1.1对照组：大鼠附睾体部上皮为假复层柱状上皮，由主细胞、基细胞、晕轮细胞、狭窄细胞、顶细胞及亮细胞组成，其中主细胞数量最多，我们主要探讨该细胞的超微结构改变。主细胞具有分泌及吸收功能细胞的超微结构特征。附睾体部主细胞较头部的矮些，细胞顶端有密集排列的细长微绒毛，其间可见一些大小不一的膜性囊泡。细胞间见有连接复合体；核位于细胞的下1/3，其外形多不规则，常染色质丰富，核仁明显；核上区胞质内有多量高尔基复合体，其扁平囊池有8～13层。常见多个高尔基复合体围绕成环形的高尔基区，其内可见丰富的清亮小泡及部分有衣小泡，顶部胞质内还含有少量内体、多泡小体及溶酶体；线粒体散在分布于胞质内；核下区有丰富的粗面内质网及少量脂滴(图1)。上皮外由薄层小管周组织环绕，包括基膜、平滑肌细胞、结缔组织纤维成分及毛细血管。

1.2单纯镉注射组：镉注射后1h，上皮细胞及小管周组织结构基本正常。镉注射后4h，主细胞多量线粒体出现髓样结构(图2)：顶部胞质内清亮小泡明显增多；核下区粗面内质网出现轻度脱颗粒现象(图3)；高尔基复合体形态无明显改变。基细胞线粒体内室肿胀；上皮基底部细胞间出现一些大空泡，管周间质水分积聚。平滑肌细胞部分线粒体内室肿胀；毛细血管内皮形态正常，连接完整。附睾管腔内有坏死脱落的上皮细胞。镉注射后24h，上皮细胞间大空泡明显增多(图4)，主细胞部分高尔基复合囊池扩张，出现髓样结构，粗面内质网脱颗粒现象加重，个别主细胞肿胀坏死。间质毛细血管内皮形态正常。镉注射后3d，部分主细胞线粒体肿胀(图5)，胞质内脂滴增多，高尔基复合体形态基本正常。细胞间水肿现象明显减轻。部分狭窄细胞粗面内质网明显扩张。附睾管腔内仍可见多量坏死细胞碎片。镉注射后7d，主细胞顶部微绒毛明显稀少、短小，胞质顶部清亮小泡明显减少，胞质内溶酶体增多。管周基底膜不规则内陷增多。间质毛细血管仍未查见形态改变。管腔内基本无精子，可见大量坏死细胞碎片(图6)。镉注射后15d，主细胞变窄，胞质量减小，胞质内细胞器稀少、高尔基复合体扁平囊池减少，溶酶体增多。基底膜不规则内陷更加明显，管周平滑肌细胞之间可见中性粒细胞浸润(图7)，间质纤维增生。毛细血管形态正常。镉注射后30～60d，上皮主细胞结构基本恢复正常，但胞质内脂滴仍较多；基底膜变平整(图8)，平滑肌细胞内仍见少量髓样结构。

1.3镉加锌注射组：注射后24h，主细胞细胞器基本正常，细胞间未见大空泡形成：平滑肌细胞线粒体正常。3d组附睾管腔内未见坏死脱落细胞；7d组见部分主细胞线粒体内室肿胀，顶部微绒毛较正常主细胞稀少；管腔内未见细胞碎片，基底膜平整，毛细血管内皮正常。15d组主细胞结构基本正常(图9)。结果表明锌对附睾体部结构保护良好，与单纯镉组24h及3、7、15d组有明显差异。

2. TPPase变化及反应产物图像分析

电镜下正常大鼠附睾体部上皮主细胞TPPase反应产物满布于高尔基复合体1～3层分泌面扁囊内(图10)。此外，在顶部质膜微绒毛、上皮细胞质膜相邻面以及小管周组织平滑肌细胞周围也可见该酶反应产物沉着。