【摘要】目的探讨甾体类性激素(sex steroid)对胸腺上皮细胞增殖相关信号转导的调节机制。方法用免疫印迹法(immunoblotting)及免疫组织化学法(immunohistochemistry)研究甾体类性激素在体外培养大鼠胸腺上皮细胞株(IT-45R1)蛋白激酶C相关的信号转导途径中的作用机制。结果(1)甾体类性激素诱导的胸腺上皮细胞的增殖受甾体类性激素和血浆抑制因子相互作用产生的质膜相关信号途径的调节；(2)细胞周期蛋白依赖激酶系在胸腺上皮细胞的细胞周期中起重要作用；(3)5α-双氢睾酮在10^-10mol/L增强细胞周期蛋白依赖激酶系的调节，而17β-E₂则呈浓度依赖性抑制细胞周期蛋白依赖激酶系的调节。结论胸腺上皮细胞增殖相关信号的转导是几条途径相互作用的结果。

SEX STEROIDS MODULATE THE PROLIFERATION SIGNALTRANSDUCTION IN CULTURED THYMUSEPITHELIAL CELLS

He Wei^△,Wang Zhanyou,Kou Sakabe*,Kanji seiki*

(Department of Histology and Embryology,China Medical University,Shenyang;

*Department of Morphology,Tokai Univeristy,School of Medicine,Japan)

【Abstract】Objective This paper was to expound the modulation mechanism of sex steriod hormones(SHs) on the proliferation related signal transduction of thymus epithelial cell(TEC).MethodsThe mechanism of action of SHs on the protein kinase C(PKC)－related signal transduction pathway was examined in cultured rat TEC line(IT－45R1)with immunoblotting and immunohistochemistry.Results(1)proliferation of TECs in response to SHs is mediated by plasma membrane associated signal pathways generated as a result of interactions between SHs and plasma－borne inhibitors;(2)the action of cyclins and cyclin－dependent families,such as cdc2 kinases,play a key role in cell cycle progression in TECs;(3)the DHT in 10^-10mol/L enhanced the modulation of cyclin－dependent kinase familes,but the 17β-E₂ shown as the concentration－dependent,inhibited the modulation of cyclin－dependent kinase families.ConclusionThe transduction of TEC proliferation related signal was the result of interaction through many pathways.

【Key words】 Thymus epithelial cells;Sex hormones; Proliferation; Cyclin－dependent kinase;Singal transduction

大量研究表明，性激素(sex hormones,SHs)是哺乳动物胸腺免疫应答的调节因子。胸腺上皮细胞(thymus epithelial cell,TECs)的增殖和功能与胸腺上皮细胞对SHs的敏感性密切相关^［1，2］。青春期后的胸腺退化主要是由于胸腺组织暴露于体循环中高水平的SHs所致^［3］。但是SHs影响胸腺功能的作用机制尚不完全清楚。我们曾报道^［1］，SHs使大鼠TEC株IT-45R1的蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性迅速增强。Rajkumar^［4］的研究结果表明，蛋白激酶抑制因子抑制大鼠子宫雌激素诱导的DNA合成。这些研究结果提示，蛋白激酶在性激素敏感细胞(包括TECs)的SHs诱导的信号转导中起关键作用。细胞周期包括G₁、S、G₂和M 4个时期，该过程的调节因子，即细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin－dependent kinases,Cdk)及其调节因子14-3-3是PKC相关信号转导中的重要表达因子。因此，本研究探讨了SHs对培养胸腺上皮细胞CdK及其调节因子14-3-3的影响。

材料和方法

1.细胞株

胸腺上皮细胞株IT-45R1来自于大鼠胸腺^［5］，该细胞株具有上皮细胞特征，对SHs高度敏感且具有产生各种胸腺激素的能力^［2，5］。

2.化学试剂

将双氢睾酮(5α-DHT)和雌二醇(17β-E₂)(Sigma产品)分别溶于纯乙醇中，制备成3×10^-5mol/L浓度，并于-20℃保存。使用前用DMEM培养基稀释，使乙醇最终浓度低于1／1 000。

3.培养条件和实验设计

IT-45R1细胞株在含有5%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中继代培养。为测定细胞增殖，以2.5×10⁴/ml浓度加于12孔培养板或8室载玻片上(Napieville,IL,USA)用下述方法37℃、5%CO₂箱培养。

由于TECs来源于大鼠的胸腺，所以TECs的增殖周期要用来自Wistar种系大鼠的同种血清来检测。为了使半抗原这种热敏感蛋白质变性，大鼠血清在56℃灭活30min,血清中的SHs用0.5%活性炭－0.05%右旋糖酐T70于37.5℃吸附1h。经如此处理的血清被称为活性炭-右旋糖酐处理血清(CDS)。CDS已被证明含有抑制细胞增殖的热稳定蛋白^［1］。用这种CDS培养基IT-45R1细胞可稳定(非增殖状态)培养5d，然后加入SHs溶液，培养72h，收获细胞，用于下列分析。

4.CdK和蛋白激酶调节因子14-3-3的免疫印迹分析

将经SHs处理的IT-45R1细胞于4℃悬浮于10mmol/L Tris－HCl(pH7.4)溶液(该溶液含有3mmol/L MgCl₂,1mmol/L PMSF和10mmol/L巯基乙醇)15min,制备细胞匀浆，高速离心后取上清进行免疫印迹^［6］。使用小鼠单克隆抗细胞周期蛋白A、B₁抗体，小鼠单克隆抗细胞周期蛋白依赖激酶(oncogene science)和抗活化的14-3-3(Morinaga Bio－Science,Japan)抗体。免疫印迹复合物用Tropix Western－Light试剂盒(Tropix,Bedford,MA,USA)测定，反应带用IBM PS/V(IBM Japan,Tokyo,Japan)和Argus－10图像处理仪(Hamamatsu Photonics K.K.,Japan)分析。

5.细胞周期蛋白依赖激酶的免疫组织化学分析

将经SHs处理的培养TECs用PBS洗涤后，4%多聚甲醛/PBS固定30min。洗涤后，10%正常羊血清室温孵育20min；小鼠单克隆抗细胞周期蛋白A、B₁抗体，以及小鼠单克隆抗细胞周期蛋白依赖激酶cdc2抗体，4℃湿盒中过夜；生物素化的羊抗小鼠IgG室温1h；过氧化物酶标记的亲和素中室温30min；DAB－H₂O₂显色10min;甲绿复染细胞核后显微镜下观察。

结果

1.SH对TEC增殖的影响

加5α-DHT于含有10%CDS的培养基使TEC的增殖产生双相反应。激素浓度为3×10^-10mol/L时，细胞增殖达高峰；当激素浓度为3×10^-7mol/L时，导致细胞增殖进行性减少。17β-E-2从低浓度到高浓度抑制细胞增殖(图1)。

图110%CDS中生长的TEC增殖产量。培养液中含有(●)3×10^-12～3×10^-7mol/L 5α-DHT及(○)3×10^-12～3×10^-7mol/L 17β-E₂。数值为来源于4个样本的平均值±标准差。*与对照组(未添加性激素)相比，P＜0.01

Fig.1Cell proliferation yields obtained when TEC were grown in 10% CDS.The serum was supplemented with:(●)3×10^-12 to 3×10^-7mol/L 5α-DHT;(○)3×10^-12 to 3×10^-7mol/L 17β-E₂.Values are the means ±s of four determinations.*P＜0.01,vs the control (no hormone).2.血清浓度对TEC增殖的影响

CDS对TEC增殖显示有统计学意义的抑制作用，这种抑制作用在加入3×10^-10mol/L 5α-DHT后消失(图2)。反之，17β-E₂不影响CDS的抑制作用(数据未出示)。

3.SHs对TEC Cdk的表达及其调节因子14-3-3活性的影响

图2含有3×10^-10mol/L 5α-DHT培养基中CDS血清浓度对TEC增殖的影响.(□)为仅添加1%～30%CDS；(■)为CDS加上3×10^-10mol/L 5α-DHT.数值来源于6个样本的平均值±标准差.*与单独添加CDS相比，P＜0.01

Fig.2 Effect of serum concentrations on cell proloferaion when TECs were grown in medium supplemented whith 1 to 30% CDS alone(□) or plus 3×10^-10mol/L of 5α-DHT(■).Values are the means ±s of six determinations.* P＜0.01，vs CDS alone.Cdk是细胞周期中的重要因子。周期蛋白A促进细胞从G₁期向S期过渡，周期蛋白B₁促进S期向G₂期的过渡。图3a和3b表明周期蛋白A的免疫印迹分析结果：在用3×10^-10mol/L及更低浓度的5α-DHT孵育的TECs，强烈诱导了周期蛋白A的表达，而该激素水平在3×10^-9mol/L及更高时，表达则明显减少；在17β-E₂处理组，周期蛋白A的表达呈剂量依赖性抑制作用，在剂量超过3×10^-10mol/L时，表达明显减<