TRANSDUCTIONAL PATHWAY FOR DEATH SIGNAL

在生物机体的正常发生发育和生长分化过程中，其细胞分裂、生长分化和细胞死亡的精密配合起着重要的作用。脊椎动物神经系统在个体发生中即使没有遇到外在损害，其神经细胞在竞争靶源有限的神经营养因子(神经细胞诱向因子neuronotrophic factors, NTFs)过程中，在特定部位和时间也会按自身的程序主动死亡，即Lockshin和Williams称之为编程性细胞死亡(programmed cell death, PCD)。哺乳动物从囊胚开始终生都有广泛、持续的细胞PCD。例如，成年人每小时有亿万个细胞发生PCD(Raff，1996)，这说明PCD在调节细胞增殖的数量中起着重要作用。这类细胞死亡有着独特的形态和生物化学特点：如染色质浓缩、核酸内切酶将核小体DNA裂解为160～180bp片段，其电泳图像呈梯阶形式；细胞的泡状外突形成包膜的凋亡小体(apoptotic bodies)；死亡细胞或其残片迅速被巨噬细胞膜的糖蛋白CD14所识别、吞噬而清除(Devitt等，1998)，没有漏出内容物，无炎症反应等，Kerr等(1972)将这些表现特称为细胞凋亡(apoptosis)。所以，细胞凋亡完全不同于细胞坏死，后者出现细胞膨胀瓦解并引起炎症反应。但是，在神经系统的PCD中也有非凋亡式的细胞死亡(Oo等，1996)。

近十几年来的研究表明，NTFs及其受体在保障特定神经细胞的存活，促进生长、分化，特别是在防止凋亡方面有显著的生物学效应；实验性NTFs或其受体基因突变，可导致动物相关神经细胞出现明显的缺陷。同时，细胞死亡基因(cell death gene,ced)或其调控基因突变，会导致本该死亡的细胞不死亡，或该存活的细胞不存活，传导死亡信号分子的定点定向突变的实验获得了同样的效果。这些研究结果为探索神经细胞因正向或负向凋亡失调所导致的退行变性或增生亢进机制和应用开辟了广阔的前景^［1～3］。

1.神经细胞凋亡是正常神经系统发育及病变中的必然过程

脊椎动物神经系统内不同部分的神经细胞凋亡的时间和程度是有差别的。如脊髓运动神经细胞凋亡的时间在鸡出现于E6.5～9.5d，大鼠为E15d；鼠的黑质多巴胺(DA)能神经细胞出现于E21d，出生后有2次凋亡高峰期，即6d及14d，而后一次高峰期恰是其靶结构(纹状体)内依赖NTFs的突触形成期(Oo和Bruke, 1996)；大鼠视网膜节细胞在出生后前5d凋亡达70％；小脑皮质颗粒细胞在出生后小鼠和人发育的前3个月均有凋亡(Lossi等，1996)。从神经细胞凋亡的程度来看，三叉神经中脑根核有75％(或85％)、听觉中继核有15％的神经元有凋亡；脑桥核、蓝斑、红核和海马主体结构则无明显的神经细胞凋亡。在成年期虽然一些神经核、皮质和神经节均保留约50％的长寿神经元，但到老化时仍会有明显的凋亡。最近通过用BRDU标记鸡胚胎脊髓运动神经细胞核的实验，发现运动神经元从出现到PCD之间有固定的间隙期(interval period)，最早出现的运动神经元最先开始PCD^［4］。另外，截肢后的运动神经元、视神经损伤后的视网膜节细胞(Bien等，1996)，或失去大量传入纤维的嗅皮质锥体细胞(Capurso等，1996)或神经退变病的神经元均发现有细胞凋亡现象^［5］。

2.神经细胞凋亡和细胞死亡基因

从线虫(C.elegans)到哺乳动物(包括人)均发现有细胞死亡基因。线虫的主要死亡基因为ced-3和ced-4，ced-3编码的CED-3蛋白酶序列与哺乳动物的白细胞介素-1β转化酶(interleukin-1β converting enzyme, ICE)同源，是半胱氨酸蛋白酶。实验显示ced-3产物杀死细胞不需要内源的ced-4；而ced-4过度表达诱导的细胞死亡需要ced-3的活化。ced-4基因变异剪接(alternative splicing)的产物CED-4L或点突变，无论在线虫或哺乳动物均可丧失触发细胞死亡效应，这表明ced-4可能在ced-3的上游起作用，或与ced-3相平行起作用。ced-9为存活基因(survival gene)，其编码的蛋白质与原癌基因产物Bcl-2族的Bcl-X_L同源，有抑制CED-4的作用，以致转染bcl-2基因或Bcl-2的线虫不会因ced-9突变而出现PCD，即能保护神经细胞和其他细胞的存活。这些基因在个体发生中都能自动地调控细胞死亡^［6，7］。果蝇的死亡基因rpr(reaper)编码的RPR蛋白酶有ICE样效应，其死亡结构域(death domain)与死亡受体(death receptors) TNFR1和Fas(见后)同源(Golstein等，1995)。rpr在细胞死亡前1～2h才表达RPR，基因的部分缺失将阻止细胞正常凋亡；基因的过度表达则导致眼视网膜脱落，但能够被杆状病毒的抑制凋亡蛋白质(P35IAP)所抑制，这表明RPR激活了CED-3／ICE介导的细胞死亡程序^［8］。最近，在哺乳动物发现的蛋白酶Apopain特异地酶解死亡底物聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，当细胞内Apopain活性增高即启动细胞死亡(Nicholson等，1995)。在脊髓肌萎缩(SMA)病相关基因第5号染色体q13的邻近q13.1为新发现的基因，编码一种与IAP同源的神经元凋亡抑制蛋白质(neuronal apoptosis inhibitory protein, NAIP)^［9］；用PCR法从λZapⅡ人胎儿脑cDNA文库和λUniZap人肝cDNA文库分离的与IAP同源的xiap、hiap-1和hiap-2基因，其表达产物均能抑制细胞凋亡(Liston等，1996)；在SMA病人运动神经元第5号染色体端粒区鉴定到20kb的运动神经元存活基因(survival motor neuron gene,SMN)，此基因在229例SMA病人中有226例发现存在缺少或断裂，其余3例则在6、7内含子处有点突变(Y272C)，这导致了病人运动神经元的退变凋亡，他们认为SMN基因是决定SMA病的基因^［10］。用原位杂交法证实SMNmRNA位于大鼠、猴中枢神经系神经元细胞质，RT-PCR法分离大鼠的SMN有90％与人的同源(Princivalle等，1996)。此外，尚有一些原癌基因通过特定途径可诱发细胞凋亡(如bad、bak、bax、bik、c-myc、p53)，或促进细胞存活(如bcl-2、mcl-1、v-abl、brc-abl)(Gajewski和Thompson，1996)。

3.死亡受体和死亡配体

触发细胞凋亡的死亡受体主要是肿瘤坏死因子(TNF)／NGF受体超家族成员，如TNFR1、Fas／Apo-1、p75(NTR)^［11］、DR-3／WSL-1／Apo-3、DR-4、DR-5(Chinnaiyan等，1996；Marsters等，1996；Pan等，1997；Sheridan等，1997)、 LTβR(淋巴细胞毒素β受体)、TRAMP(Bodmer等，1997)，它们通过其胞外结构域与相应的死亡配体或因子(death ligands or factors)相结合，触发死亡受体胞内结构域产生死亡信号，传给胞溶质中的信号媒体分子；也可通过细胞表面另一类介导病毒进入细胞的受体，如疱疹病毒进入细胞的介体(HVEM)(Motogomery等，1996)、禽类细胞病白血病-肉瘤病毒介导凋亡的受体(CAR1)(Brojalsch等，1996)导致细胞凋亡。TNF／NGF受体超家族成员分子结构的特点是跨膜的I型膜蛋白，其胞外结构域大约每40个氨基酸中含6个半胱氨酸的不完全重复片段，可与配体结合；其胞内结构域均含有死亡结构域(约含80个氨基酸)，是死亡信号产生及死亡信号分子相互结合的部位，也是决定蛋白-蛋白相互作用顺序和活化转录因子NF-κB的部位。TNFR死亡结构域突变往往发生在α-螺旋结构的保守氨基酸处，因此可以干扰受体死亡信号的传导。

3.1Fas／Apo-1：80年代末，Yonehara S和Krammer P两个研究组分别在成纤维细胞和免疫细胞中发现了表面抗原。人的Fas有325个氨基酸，其基因定位于第10号染色体长臂(q)，小鼠则定位于第19号染色体，有9个外显子。人的Fas抗体与小鼠表达Fas的转化细胞交联后5h内细胞凋亡，表明Fas为细胞表面传导死亡信号的受体(死亡受体)。对Apo-1进行与Fas相同方式的实验，结果完全一样，并证明两者的分子序列完全一致。这表明Fas／Apo-1是相同性质的受体，同属Ⅰ型膜蛋白，为TNF／NGF受体超家族成员，目前常用CD95(分化抗原簇抗体)来表示Fas(Oehm等，1992)。这类受体的胞外结构域富集半胱氨酸亚结构域，胞内结构域则含有死亡结构域。CD95在不同组织和细胞株表达量差别很大，物种间的差别明显。如小鼠胸腺高水平地表达Fas，在人却很弱。在常染色体隐性突变的Lpr小鼠，其Fas238位缬氨酸被天冬酰胺取代，其细胞便具有了抗凋亡性能。

Fas配体(CD95L)分子量约40kD，克隆小鼠和人的CD95L属Ⅱ型膜蛋白，C-终端在胞外，中间部为疏水区的跨膜部，N-终端则无信号序列。CD95L胞外部150个氨基酸序列与TNF族成员的TNF、CD27L、CD40L、CD30L同源。在表达CD95的COS细胞与rCD95L结合之后5h内细胞凋亡，表明CD95L为CD95的死亡配体或因子(Suda等，1993；Nagata和Suda，1995)。小鼠CD95L序列有76.9％与人的完全一致。一般说，CD95介导的凋亡信号传导在细胞表面需要有足够密度的CD95、CD95L与CD95结合成为寡聚体和凋亡敏感的细胞等3个因素。CD95发出的死亡指令直接传导给有死亡结构域的胞内信号媒体分子FADD／MORT1，再传递到蛋白酶(后述)。

3.2TNF和TNFRs：肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,NTF)是70年代中期在免疫细胞最早发现的细胞死亡因子，其受体迟至90年代中才分离鉴定为TNFR1(CD120a)和TNFR2(CD120b)，两者在广泛的组织均有表达。它们象CD95、p75(NTR)、CD40一样同属Ⅰ型膜蛋白，为TNF／NGF受体超家族的成员。TNF对多种类型细胞有引起凋亡、抗病毒活性、激活转录因子(NF-κB)和保护宿主抗拒微生物及病原菌等生物学效应(Pfeffer等，1993；Rotte等，1993)。CD120a既能触发细胞凋亡又能激活NF-κB，少量通过CD120b起作用的也限于免疫系统。CD120a和b的胞外部分～30％氨基酸序列完全一致，富集半胱氨酸，两者性能差别主要取决于其胞内部分的初级氨基酸序列无相似性。CD120a的胞内部分象CD95一样含有～80个氨基酸的死亡结构域，为诱导细胞凋亡和激活NF-κB的分子基础；而CD120b的胞内部分为TRAF(TNFR相关因子TNFR-associated factor，TRAF)结构域，参与活化N