【摘要】目的获得编码人酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)催化核心cDNA片段，并观察其表达。方法采用人的全长THcDNA为模板，设计特定的引物进行PCR扩增反应并构建真核表达载体——质粒pCMVTH_C。在对目的片段测序后，将重组质粒转染到大鼠原代培养骨骼肌细胞内，用免疫组织化学方法检测其表达。结果获得了编码N－端缺失145个氨基酸的酪氨酸羟化酶催化结构域的cDNA片段，其表达载体构建正确。插入片段的DNA序列与人THmRNA相应序列完全一致，将其转入肌细胞内测得有酪氨酸羟化酶表达。结论本研究结果为帕金森病的基因治疗提供了有价值的新工具。

CLONGING AND EXPRESSION FOR DNA FRAGMENT OF CATALYTICDOMAIN OF HUMAN TYROSINE HYDROXYLASE

Chen Hong, Zhang Chengbo, Xu Qunyuan^*Δ， Zheng Shaopeng^*，Zhao Chunli^*

(Dapartment of Biochemistry,^*Beijing Institute for Neurosciences,Capital University of Medical Sciences)

【Abstract】 Objective In order to obtain catalytic core of human tyrosine hydroxylase(TH) cDNA and observe its expression.Methods The full－length of cDNA from human TH was used as template and the specific oilgonucleotide primers were designed for Polymerase Chain Reaction(PCR).An eukaryotic vector,plasmid pCMVTH_C was then constructed.The newly constructed pCMVTH_C was transfected in vitro to the cultured primary muscle cells from the rat after DNA sequence analysis.The expression of TH was tested by using a method of immunocytochemistry.Results The cDNA fragment containing a catalytic domain of human TH(TH_C) with encoded N－terminal removal of 145 amino acid residues was harvested.An eukaryotic vector,plasmid pCMVTH_C was then proved correct.DNA sequence analysis indicated that the inserted fragment was consistent with that of human TH mRNA.The expression of TH was shown in muscle cells by immunocytochemistry analysis.Conclusion The results of the present study may provide a new way for gene therapy of Parkinsonism.

【Key words】 Tyrosine hydroxylase; Mutagenesis; Catalytic domain

酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH;EC 1、14、16、2)是儿茶酚胺类神经递质即多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素生物合成过程所需的限速酶，它以四氢生物喋呤啶(BH₄)为辅酶，催化酪氨酸的羟化而生成多巴(DOPA)^［1］。已知在患帕金森病(Parkinson disease,PD)时，脑内多巴胺(dopamine,DA)的减少与此酶活性低下有关^［2］。因此对PD模型动物来说，若将TH基因植入脑内，便可以提高脑内DA水平而达到基因治疗目的^［3］。

从上述机制可以看出，植入脑内的外源性TH基因能否高效表达酶的活性是基因治疗PD有无疗效的关键。近年来，Walker等^［4］用突变法证实了大鼠TH分子是由N－端调节结构域和C－端催化结构域所组成的。他发现，如切去部分N－端，即剩下C－端催化核心蛋白，其活性比全酶可高出1.8～2.5倍。

因此我们设想，如果能获得人TH催化核心的cDNA片段，将其克隆到表达载体并转入真核细胞内，使其能表达出酶的催化核心序列，则应得到高催化活性的酪氨酸羟化酶；若将转有此类基因的细胞引入脑内，就会比通常所用的TH全酶基因更有效。

材料和方法

1. 获取人TH催化结构域cDNA片段

根据大鼠TH催化结构域对应的DNA碱基序列^［4～6］，推导出人TH所对应的催化结构域的碱基部位，并设计出特定的引物，包括：(1)5’端引物(25bp)为：5’CGAAGCTTATGGCCGCCCTGC－TCAG 3'，其中含有限制性内切酶Hind Ⅲ位点、起始密码子及人TH₂146～150氨基酸残基密码子；(2)3’端引物(26bp)为：5’CCTCTAGACTAGCCAATGGCACTCAG 3’，含有限制性内切酶XbaⅠ位点、终止密码子及人TH₂终止密码子前面5个氨基酸残基的密码子。上述引物寡聚核苷酸由赛百盛生物工程公司合成。

以质粒pRrchTH(Somatix Therapy Corporation 提供)上人的全长TH₂cDNA为模板，用耐热多聚酶DyNAzyme NDA Polymerase (Finnzymes Oy 提供)催化PCR扩增反应，共进行25次循环(包括94℃下变性1min和68℃下退火及延伸1.5min)，从而获得N－端缺失145个氨基酸的人TH催化结构域(catalytic domain of TH,TH_C)的cDNA片段(TH_CcDNA)。

2. 构建表达质粒pCMVTH_C

先将PCR扩增后获得的产物进行乙醇沉淀，再经过PURIGEN试剂盒(天象人生物工程公司)回收，得到纯化的目的基因TH_CcDNA，定向插入质粒载体pRcCMV(购自Invitrogen Co)内以构建表达质粒pCMVTH_C。构建方法如图1所示：

图1质粒pCMVTH_C的构建路径H.Hind Ⅲ X.Xba Ⅰ S.ScaⅠ

fig.1 A Strategy of pCMVTH_C reconstruction .H:Hind Ⅲ, X:XbaⅠ, s:ScaⅠ

进行定向连接反应后，用质粒转化DH₅α大肠杆菌感受态细胞；经转化后的大肠杆菌置于含Amp^R的LB琼脂板上，在37℃中生长16h。从中随机挑选12个克隆，用煮沸法小量提取质粒DNA^［5］，用限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ和ScaⅠ进行酶切和电泳分析，以验证重组质粒是否携带有目的基因及基因插入方向；经确认正确后，用碱裂法大量制备质粒pCMVTH_C以用于基因转移及插入DNA序列分析。

3. 分析TH_cCDNA序列

已确认正确的重组质粒pCMVTH_C，用双脱氧法对外源性目的基因进行DNA序列分析(由赛百盛生物工程公司测定)。

4. 原代骨骼肌细胞的培养及基因转移

取新生SD大鼠四肢部的骨骼肌按已报道的方法^［3］进行原代细胞培养，培养到第2～3d时用于DNA转移。

用脂质体Lipofectin (Gibco/BRL)介导转染外源性目的基因。即于转染前24h，将原代骨骼肌细胞接种于培养皿中，使40%～60%的细胞融合；再将新构建的质粒pCMVTH_C和Lipofectin分别用无血清培养基Opti－MEM(Gibco/BRL)稀释至100μl；将两种溶液逐滴混合后，加到原代培养骨骼肌细胞中，置于37℃、5%CO₂条件下培养4～6h后，再换入含15%小牛血清和85%MEM的正常鼠肌细胞培养基内，放入培养箱内培养。

用与上述相同的方法和程序将质粒pRcCMV转入大鼠原代骨骼肌细胞内作为对照。

5. 检测培养细胞TH_C的表达

转染48～72h后，用免疫组织化学方法检测培养细胞的TH-C表达。即用小鼠抗人TH₂单克隆抗体(1∶5 000，Sigma Bio Science)、生物素标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶300，中山生物技术公司)和HRP标记的抗生物素复合物(1∶300，中山生物技术公司)，按照SP法显示TH_C免疫活性。

结果

1. 人TH_CcDNA的获得

在对所设计的特定引物进行PCR扩增后，得到了编码N－端缺失145个氨基酸的人TH催化结构域的cDNA(TH_CcDNA)，其片段长度为1.05kb(图2)，片段两端含有HindⅢ和XbaⅠ酶的识别位点。

2. 质粒pCMVTH_C的构建及鉴定

分别将质粒载体pRcCMV(5．446kb)和目的基因TH_CcDNA(1．05kb)用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ进行消化，产生带有酶切末端相匹配的5.34kb的质粒载体片段及1.05kb的目的基因片段(图3)；经琼脂糖凝胶电泳分离及PURIGENE试剂盒纯化后定向连接、转化，得到重组的质粒pCMVTH_C，长度为6.40kb(用HindⅢ单酶切显示)；用HindⅢ、XbaⅠ双酶切分析，显示有5.34kb和1.05kb片段，说明质粒含有TH_cCDNA片段的插入；再用XbaⅠ、ScaⅠ双酶切鉴定基因插入方向，产生4.0kb和2.4kb两个片段，证明重组质粒中TH_C基因插入方向正确(图4)。

3. TH_cCDNA序列分析

由于质粒载体pRcCMV中的polylinker两侧具有T₇和Sp₆通用序列，因此在切去polylinker、插入TH_C基因后所形成的重组质粒pCMVTH_C可以直接作为测序质粒，用双脱氧法对插入片段进行DNA序列分析，再与人THmRNA相应序列(genebank 91120)比较，测序结果与THmRNA相应序列完全一致。

4. 被转染肌细胞的基因表达

用脂质体Lipofectin介导转染新构建的pCMVTH_C后，继续培养48～72h，所有原代培养肌细胞分化成肌管细胞。它们中间30%～40%<