【摘要】目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)对AD模型鼠脑植入胚基底前脑后行为改善和移植区胚胆碱能神经元发育生长的影响。方法用使君子酸损毁SD大鼠基底大细胞核制成AD模型，分成BDNF、NGF、BDNF+NGF及单纯移植对照4组。在额、顶叶皮质植入同种胚基底前脑细胞悬液，前3组含相应神经营养因子，移植后每2d向侧脑室灌注相应神经营养因子共7次。移植后1、2.5和4个月时行避暗回避试验和跳台试验，最后脑切片经AChE组织化学、ChAT和LNGFR免疫组织化学等染色，对移植区中的神经元及纤维作定量分析和图像处理。结果移植后应用神经营养因子的动物较对照组行为改善明显迅速，BDNF+NGF组行为改善又较BDNF组或NGF组明显。形态学证实，应用神经营养因子动物移植区中AChE阳性神经元数、16 900μm²网格中AChE阳性纤维交点数及AChE阳性神经元面积均优于对照组，BDNF+NGF组的结果又好于BDNF组或NGF组。结论BDNF与NGF一样能促进植入胚基底前脑的AD模型鼠行为改善和移植区胚胆碱能神经元的发育生长，BDNF和NGF联合使用比单独使用一种因子更为有效。

MODULATION OF BDNF AND NGF ON THE DEVELOPMENT OF EMBRYONIC CHOLINERGIC NEURONS IN BRAIN GRAFTS OF AD MODEL RATS

Jin Guohua, Xu Huijun^Δ, Wu Yiming,Zhong Shizheng

(Department of Neurobiology,Nantong Medical College,Nantong;

Department of Anatomy,The First Military Medical University,Guangzhou)

【Abstract】 Objective The effects of BDNF and NGF on the behavioural improvement and the development of embryonic cholinergic neurons of grafts in AD model rats were studied.Methods AD model rats were obtained by injections of quisqualic acid into the nucleus basalis magnocellularis.The frontal and parietal cortex of AD model rats received the transplantation of the same species fetal basal forbrain suspensions with BDNF,NGF,BDNF+NGF and without neurotrophic factors.Moreover the neurothophic factors were injected into the cerebral ventricle every two days for seven times.Step－through passive avoidance and active avoidance tests were carried at 1,2.5 and 4 months after grafting.Brain sections were stained with AChE histochemistry and ChAT or LNGFR immunohistochemistry.The number of neurons and fibers in the grafts was analysed quantitatively with computer image system.Results The behaviour of animals infused with neurotrophic factors improved more obviously and quickly than the animals infused with no neurotrophic factors.The behavioural improvement of BDNF+NGF group was superior to that of BDNF or NGF group.The morphology demostrated that the number of AChE positive neurons,fibers' crossing points of 16 900μm² grid and cell size in grafts of animals infused with neurothophic factors were also superior to that of the animals without neurotrophic factors,and the data of BDNF+NGF group were better than that of BDNF or NGF group.Conclusion BDNF,as same as NGF,could promote the behaviour function and the development of embryonic cholinergic neurons of grafts in AD model rats and the combined use of BDNF and NGF was more effective than one kind molecule alone.

【Key words】 BDNF; NGF; Embryonic cholinergic neurons; Brain transplantation; AD model rat

老年性痴呆(Alzheimer disease,AD)的病理变化除在大脑皮质出现以β－淀粉样蛋白沉淀为主的老年斑和神经原纤维缠结外，基底前脑胆碱能神经元丧失、皮质胆碱能神经纤维支配减少是主要的病理改变。人们曾尝试用多种方法治疗AD，但效果均不理想。有报道用富含胆碱能神经元的胚基底前脑移植到宿主新皮质或海马能明显改善AD模型鼠的学习和记忆能力^［1～3］。近年来研究表明，神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain－derived neurotrophic factor,BDNF)对体外培养的胚胆碱能神经元具有明显促进成活和分化作用^［4，5］，经侧脑室或脑实质应用NGF、BDNF亦能保护基底前脑胆碱能神经元免受隔海马离断而致的退变，并减轻痴呆程度^［6，7］。本实验将BDNF、NGF加入富含胆碱能神经元的胚基底前脑细胞悬液中，植入AD模型鼠新皮质，并通过脑室灌注神经营养因子，观察BDNF、NGF以及它们联合使用对AD模型鼠脑移植区胚胆碱能神经元发育生长的调控，为将神经营养因子与脑移植相结合应用于临床治疗AD等神经系统退行性疾病提供实验和理论依据。

材料和方法

1. AD模型鼠的制备

220～250g SD大鼠，性别不拘，用复合麻醉剂Chlorpent经腹腔麻醉(2ml/kg)，固定于立体定位仪，参照Paxinos图谱，根据基底大细胞核(NBM)的位置，取左侧头尾2个注射点，每点注射0.14mol/L的使君子酸(QA，Sigma公司)0.5μl，速度0.1μl/min，留针5min。1周后进行避暗回避试验，若滞留时间小于300s(正常鼠大于900s)则为记忆能力低下，随机抽取其中10%的动物经AChE组织化学和ChAT免疫组织化学染色证实NBM被损毁，则该批鼠确定为AD模型成功鼠。

2. 胚脑移植和神经营养因子的应用

取24只AD模型鼠随机分成BDNF、NGF、BDNF+NGF和单纯移植对照(对照组)4组，每组6只。

取E15～17(头臀长12～16mm)的同种大鼠胚基底前脑原基，根据Bjorklund^［8］的方法制成每10μl含1块胚基底前脑原基的细胞悬液，按分组要求，在悬液中分别加入重组人BDNF(美国Saint Louis大学徐晓明博士惠赠)和NGF(7s，宝灵曼公司)，浓度为0.25g/L，对照组不加神经营养因子。

AD模型鼠麻醉固定于立体定位仪，取左侧额、顶叶皮质为移植点。额叶坐标为A=1.7mm，L=3.0mm,V=2.2mm(脑膜下)；顶叶坐标为A=-1.3mm，L=4.6mm，V=2.8mm(脑膜下)。每点在10min内用微量进样器注入7.5μl细胞悬液，留针10min，缓慢退针。移植完毕，将长5mm带芯套管插入同侧侧脑室，用聚甲基丙烯酸甲酯将其快速固定于颅骨，按分组将用人工脑脊液配制的相应神经营养因子4μl(5g/L)注入侧脑室，1次/2d，共7次。于最后1次灌注的次日拔管。对照组灌注同量人工脑脊液。

3. 行为测试

测试仪器和方法同施碧涛报道^［9］。

3.1避暗回避试验：在注射QA后1周及移植后1、2.5及4个月时进行，移植后进行时增设正常对照组(6只动物)，记录试验第3d的探索次数和第6d的滞留时间。

3.2跳台试验：在移植后1、2.5及4个月避暗回避试验结束后进行，记录第7d的主动及总回避(主动+被动)反应阳性率。

4. 形态学检测

行为测试完毕，动物麻醉后经升主动脉灌注100ml生理盐水和400ml 4%多聚甲醛0.1mol/L PBS(pH7.4)，在立体定位仪上取前囟前后4mm一段脑，后固定4h，入4℃、20%庶糖0.1mol/L PBS(pH7.4)中，次日行冰冻连续切片，厚40μm，共收集4套。第1套尼氏染色；第2套乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)组织化学染色；从第3、4套中挑选部分有移植区的切片作胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)和低亲和力神经生长因子受体(low affinity nerve growth factor receptor,LNGFR)免疫组织化学染色，一抗为购自宝灵曼公司的小鼠ChAT和LNGFR单克隆抗体，工作浓度分别为10mg/L和5mg/L，二抗为Vector公司生物素化的兔抗小鼠IgG，1∶200稀释，用ABC法、DAB硫酸镍铵加强法呈色。AChE组织化学染色切片进行(1)计数移植区AChE阳性神经元数；(2)参照Lewis^［10］方法，在×600显微镜下，有移植区的切片随机抽取3个视野，计数移植区中AChE阳性纤维在16 900μm²网格中与纵横线的平均交点数；(3)每张有移植区的切片随机抽取4只AChE阳性神经元，每只动物共40个细胞，用MIAS-300计算机图像处理系统进行细胞面积分析。

5. 统计分析

探索次数、滞留时间和AChE阳性神经元的细胞数、纤维交点数及面积进行方差分析和SNK检验，各组数据先行方差齐性检验，若方差不齐，平方根变换后再行检验。主动及总回避反应阳性率进行χ²检验。

结果

1. 行为测试结果

1.1避暗回避试验：移植前4组模型鼠避暗回避试验的探索次数和滞留时间方差分析P均＞0.05，说明4组模型动物行为无显著性差异。移植后1个月，各实验组的探索次数和滞留时间与正常对照组相比有较大差距；在4组实验动物中，应用神经营养因子的3组动物与单纯移植对照组相比，探索次数明显减少，滞留时间明显延长。至2.5和4个月时，各实验组的探索次数和滞留时间逐渐接近正常对照组，但以BDNF+NGF组较为明显，单纯移植对照组与正常对照组仍有差距；4个实验组的探索次数进<