【摘要】目的对以人白介素-2在原代培养骨骼肌细胞中的表达作为肿瘤基因治疗模式进行新的探索；方法将人白介素-2 cDNA片段与CMV启动子及RSV启动子重组，通过Lipofectin介导将得到真核表达载体pCMV-IL₂和pRSV-IL₂转入原代培养的骨骼肌细胞，并用免疫组织化学方法观察白介素-2的表达；结果pCMV-IL₂和pRSV-IL₂经酶切鉴定正确，免疫组织化学观察到约有10%左右细胞表达了白介素-2cDNA；结论不同启动子表达情况并无差别，质粒DNA为今后肿瘤基因治疗提供了新的途径。

THE HUMAN INTERLEUKIN-2 EXPRESSION IN PRIMARY

SKELETAL MUSCLE CELLS OF THE RAT

Pan Haiyan^△, Tian jingsheng, Wang Ke, Zhao Chunli, Zheng Shaopeng, Xue Shaobai^*

(Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical sciences,Beijing,

*Molecular and Cellular Program,Biology Department of Beijing Normal university,Beijing)

【Abstract】 Objective By using hIL₂-muscle model to exploit a new gene therapeutics for cancer.Methods Two mammalian expression vectors were constructed,which contained 1kb human interleukin-2 cDNA,and were transfected into primary skeletal muscle cells of the rats mediated by lipofectin(hIL₂-muscle model).The hIL-2 expression in primary muscle cells was detected by immunohistochemical stain method.Results Identification of pCMV-IL₂ and PRSV-IL₂ was confirmed by digesting with restrictive endonucleases,about 10% positive cells were observed and the expression level of pCMV-IL₂ and pRSV-IL₂ had no difference in the muscle cells.ConclusionRecombinant plasmid DNAs might be suitable for gene therapeutics for cancer.

【Key words】 hIL₂; Muscle cells; Lipofectin mediated gene transfer

目前，对肿瘤的基因治疗研究正方兴未艾、发展迅速。肿瘤基因治疗中大约有1/3的方案是将细胞因子基因导入肿瘤细胞后作为肿瘤疫苗植入体内，以期持续分泌活性细胞因子来达到增强抗肿瘤免疫反应的目的^［1］。在诸多细胞因子中，白介素-2(interleukin-2,IL₂)是体内一种重要的参与免疫调节的细胞因子，也是肿瘤临床治疗中应用最早的细胞因子^［2］。相反，由于IL₂在血液中半衰期短，反复输入IL₂会产生严重的毒副作用，因此用体内直接输入IL₂的方法来治疗肿瘤有很大的缺点^［3］。用IL₂基因修饰的肿瘤细胞可以使之在肿瘤部位表达分泌，从而增加了IL₂的靶向性，而且肿瘤疫苗还会诱导特异性的抗肿瘤免疫反应，故用IL₂基因导入肿瘤细胞行肿瘤基因治疗有很好的前景。然而，以肿瘤细胞作为靶细胞也有许多不足之处^［4］：肿瘤细胞自体建系困难，稳定的自体细胞系除了在黑色素瘤和肾癌患者中约30%病人可建立稳定的自体细胞系外，在其他患者尚未见成功，将永久性的细胞系回输体内有易于癌化趋势。因此我们拟采用原代培养的骨骼肌做为靶细胞转入IL₂基因，希望通过其能分泌细胞因子达到治疗肿瘤的目的，为肿瘤的基因治疗提供新途径。

材料和方法

1. pGEM-3zf(+)-IL₂多克隆载体的构建

用限制性内切酶PstI酶切pGEM-3zf(+)质粒(购自华美生物工程公司)，与纯化的1.0kbh-IL₂ cDNA片段(两端pstI酶切，由美国Michigan大学医学中心Thompson CB教授惠赠)，用T4连接酶(华美生物工程公司)连接；转化感受态菌DH5_α或JM109，将细菌涂布于含X-gal和IPTG的平板上进行蓝/白斑筛选，酶切鉴定阳性克隆(图1)。重组质粒的提取、纯化、酶切、片段回收、连接及大肠杆菌感受态制备均参见文献［5］。

2. 真核表达载体pCMV-IL₂构建

用pCMV-LacZ质粒(美国Wisconsin大学Waisman中心惠赠)，经限制性内切酶HindⅢ、EcoR Ⅰ(华美生物工程公司)双酶切，去掉3.0kb的LacZ基因，回收含CMV启动子的4.3kb片段；pGEM-3zf(+)-IL₂经相同双酶切处理，提取其中1.0kb的h-IL₂cDNA片段，与含有CMV启动子的DNA片段经T₄连接酶连接，建成pCMV-IL₂真核载体(图2)。

图1多克隆载体pGEM-IL2构建示意图

Fig.1 Construction of recombinant vector pGEM-IL2.

图2表达载体pCMV-IL₂构建示意图

Fig.2 Construction of eukaryotic expression vector pCMV-IL2.

3. 真核表达载体pRSV-IL₂的构建

将pRSV-LacZ质粒(美国Wisconsin大学Waisman中心惠赠)，经限制性内切酶HindⅢ、pvuⅡ(华美生物工程公司)酶切，去除其中的LacZ基因，回收其中含有RSV启动子的4.0kb基因片段；将pGEM3zf(+)-IL₂经HindⅢ、HincⅡ(华美生物工程公司)双酶切，回收其中1.0kb h-IL₂ cDNA片段，与RSV启动子经T4连接酶连接，构建pRSV-IL₂真核载体(图3)。

图3表达载体pRSV-IL2构建示意图

Fig.3 Construction of eukaryotic expression vector pRSV-IL₂

4. 原代骨骼肌的培养

取新生2～5d的SD大鼠的四肢骨骼肌组织，剪成肉糜后用胰蛋白酶(1∶250，Sigma)和胶原酶(Gibco/BRL)消化，制成细胞悬液并用20μm孔径的滤膜过滤去除组织碎块，所得悬液用Percoll(Sigma)进行密度梯度离心，得出纯化干细胞以5×10⁵细胞密度在35mm平皿内进行原代培养。培养基含5%鸡胚浸出液(Gibco/BRL)、15%马血清(天津血研所)、和80%MEM(Gibco/BRL)。前3d每日换液，以后隔日换液。

5. Lipofectin介导的基因转移

将质粒pCMV-IL₂、pRSV-IL₂以及作为阳性对照的质粒pRSV-LacZ与Lipofectin分别用无血清培养基(Opti-MEM)稀释至0.75ml，然后逐滴混匀，形成DNA-Lipofectin复合物；将培养2～3d的原代骨骼肌细胞用无血清培养基洗3次后加入DNA-Lipofectin复合物，在37℃、5%CO₂条件下放置4～6h，经10%DMSO冲击后，加入完全培养基，继续培养2～3d。

6. ABC免疫组织化学法检测人白介素-2的表达

将35mm平皿取出，对其中培养的转基因后细胞进行免疫组织化学染色，以PBS(0.01mol/L pH7.4)洗2次，用5%戊二醛固定5～10min，以PBS洗(5min×3)。加入含0.1% Triton X-100和1.5%正常马血清的PBS缓冲液，室温下振荡孵育30min，移入鼠抗人白介素-2单克隆抗体(1∶100，购自军事医学科学院)中4℃孵育24h，PBS洗(5min×3)。加入ABC复合物(1∶50)，37℃孵育30min，0.05mol/L Tris.HCl缓冲液洗(5min×3)，加入含0.5g/L DAB的Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，含0.003% H₂O₂)中呈色，室温下孵育5～10min。对转入pRSV-LacZ的肌细胞阳性对照经X-gal组织化学染色，方法参见文献［6］。

结果

1. 多克隆载体pGEM3zf(+)-IL₂的鉴定

在涂布含有X-gal和IPTG的LB Amp+平板上，长有数百个细胞克隆，蓝和白的比例接近1∶1。用HindⅢ单酶切分析随机挑取的6个白色克隆，全有h-IL₂ cDNA插入，用XbaⅠ酶切分析，其中1号和6号是正向克隆，3号是反向克隆(图片未附)。HindⅢ、EcoR Ⅰ分别单酶切下产生4.2kb单一条带，XbaⅠ酶切下产生两条带，即正向0.6kb+3.6kb，反向0.4kb+3.8kb(图4)。

2. 真核表达载体pCMV-IL₂和pRSV-IL₂的构建

pCMV-IL₂组建后全长5.3kb，pRSV-IL₂组建后全长5.0kb，经酶切鉴定后显示构建正确(图5)。

3. 真核表达载体在原代培养的骨骼肌细胞中的表达

骨骼肌原代培养中，前3d的培养细胞以成肌细胞(myoblast)形式存在；培养3d后细胞拉长并出现多核，转化为肌管细胞(myotube)，以后融合成骨骼肌细胞，在显微镜下可见骨