【摘要】目的建立体外培养的脊髓胶质细胞机械损伤模型，观察机械性损伤刺激后，混合性胶质细胞内不同细胞的形态变化及其特性。方法14～15d胎龄的小鼠脊髓制成细胞悬液后，在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养4周，形成富含星形胶质细胞的平铺混合胶质细胞，用塑料滴头刮损后，在刮损缘的反应性胶质细胞增生，肥大，向刮损裸区内生长并发生细胞分裂。结果增长的细胞沿刮损方向呈极性排列，可伸出纤长的突起，突起上有串珠样结构自胞体向突起末端移动，并可相互间发生融合。结论免疫细胞化学染色表明损伤边缘的胶质细胞GFAP染色加深，但进入损伤区的细胞并非GFAP阳性，也不为识别纤维细胞抗原的抗体所标记，其可能的来源和特性还有待进一步确定。

MORPHOLOGICAL CHANGES OF CULTURED SPINAL CORD

MIXED GLIAL CELLS AFTER MECHANICAL INJURY

Xu Hanpeng^△,Liang Zhe,Ju Gong

(Institute of Neuroscience, The Fourth Military Medical Univesity,Xi'an)

【Abstract】Objective To investigate the response of embryo spinal cord glia cells to mechanical injury in mixed glia culture of E14-15d mouse embryo spinal cord.Methods The E14-15d mouse embryo spinal cord was dissected in sterile condition,and cultured in incubator at 37℃5%CO₂ for 4 weeks to obtain the mixed glia cells enriching astrocytes.A mechanical scratch was done on the cell layers by a plastic tip.Phase contrast microscopic photos were taken every 10 min for 48hrs.The cells were then stained by ABC immunocytochemistry method for antibodies against astrocytes marker GFAP,oligodendrocytes marker GC,neuron specific NSE and fibroblast specific Thy1.1.Results About 4 hours after the injury,cells started to invade from the scratch edge into the blank region.These cells had long processes.Vesicles were seen moving from the cell body distally.The vesicles could fuse with each other.The processes were found to elongate and retract rapidly.Mitosis could be seen sometimes.NSE and Thy1.1,or GFAP could label none of the cells invaded to the blank region.Some could be recognized by GC,whereas the GFAP was stained heavily at the edge.Conclusion The cells were found migrating actively into the scratched region.The characteristics of these cells remains to be identified.Presumably,astrocytes would be the most active elements.However,none of the cells were GFAP positive.Some of the cells were GC positive indicating that they were oligodendrocytes.But they comprised only a minor part of the whole cell population.It is likely,therefore,the expression of GFAP in astrocytes may vary under different conditions and the reactive astrocytes have some different properties from their ordinary situation.

【Key words】 Cell culture;Glia cell;Injury

CNS损伤后胶质细胞的反应虽然已进行了大量的研究^［1］，但其详细的细胞及分子机制仍不清楚，由于在体研究对实验结果的解释上存在困难，使得对这一问题的体外研究受到重视，为此人们建立了多种离体的中枢损伤胶质细胞反应模型。其中的Yu^［2］胶质细胞刮损模型因其重复性好，操作简单而被广泛采用。本实验应用刮损模型对脊髓混合性胶质细胞机械损伤后的各种细胞的形态学变化进行了动态观察和免疫细胞化学研究。

材料和方法

1.细胞培养

采用本实验室改良的Ransom^［3］方法。24孔塑料培养板每孔以鼠尾胶涂布后吹干，孕14～15d昆明种小鼠脱颈处死后，无菌条件下取出双侧子宫置冰盒上，解剖显微镜下剥离胎鼠脊髓，置D1-SGH(D1为无钙镁离子的Puck液，SGH为蔗糖和HEPES缓冲液)液中，仔细剥去血膜，吸去D1液后，剪碎脊髓，加入0.125%胰酶消化液，在37℃消化20min，吸去消化液，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，室温停留10min,DMEM培养液洗1次，用火焰抛光的吸管在含20%胎牛血清的DMEM培养液中将消化后的组织块吹打成细胞悬液，用血球计数板计数后，将细胞悬液用含20%胎牛血清的DMEM培养液接种于铺有鼠尾胶的培养孔(5.0×10⁵/cm²)，37℃，5%CO₂孵箱孵育，3d后换以含10%胎牛血清的DMEM培养液，以后每隔3d换液，培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液。

2.损伤及观察

培养4周后，用塑料滴头将已平铺成层的胶质细胞作纵横划痕，连续48h相差显微镜观察损伤区域边缘胶质细胞的动态变化并摄片。

3.免疫细胞化学染色

吸去培养液，0.01mol/L PBS洗1次，培养孔内加4%多聚甲醛，4℃固定1h，PBS洗3次，每次5min,常规ABC法染胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP 1∶5 000)，半乳糖脑苷脂(galaclocerebroside,GC 1∶200)，纤维细胞抗原抗体(Thy1.1 1∶100)，神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE 1∶200)，染色结果摄片保存，每次实验重复3次。同时以相应一抗动物的正常血清代替一抗作为对照，实验中所用抗体间预先经测试未发现有免疫交叉反应。

结果

培养的胚胎期(E14～15)小鼠脊髓细胞在含10%胎牛血清的DMEM培液内生长4周后，在相差显微镜下观察可见细胞分为两层：上层为散在分布的折光性强的小细胞，多呈圆形，部分略呈多角形，有纤细突起沿胞体呈放射状分布，突起可有复杂分支，据其形态可判断为少突胶质细胞。下层为扁平折光差的大细胞，胞核明显，相互排列紧密，铺满整个培养孔，相互界限不清，是星形胶质细胞。

经过划痕后，划痕区形成约500μm宽的空白裸区，边缘清晰整齐，在星形胶质细胞下面可见有疏松排列的细胞(图1)，相差观察损伤边缘的细胞，可发现随时间推移，边缘细胞可发生一系列动态变化：损伤后4h，即有细胞从损伤边缘缓慢移入划痕裸区内，随后进入裸区的细胞逐渐增多，这些细胞可向不同方向伸出并回缩长短不一的突起，突起伸出及回缩速度很快(图2～4)，并可发生细胞分裂(图5～7)。进入裸区的细胞形态大小不一，形成的突起可以长达10倍于胞体直径，突起上可有折光性很强的膨体样结构，并可沿突起向其末端移动，同一突起上不同的膨体结构可相互间发生融合。不同细胞的突起长度及膨体数目及移动速度会有不同，但一般均在突起末端有一膨体。胞体内类似胞核的结构可在胞体内移动(图9～11)。

免疫细胞化学研究表明，上层小圆细胞可被识别少突胶质细胞的GC抗体标记，在小圆细胞下的细胞层则为识别星形胶质细胞的GFAP抗体标记(图12，13)。损伤后在损伤边缘的GFAP染色加深，但进入裸区的细胞不为GFAP标记(图14，15)。抗纤维细胞的Thy1.1和抗神经元成分的NSE染色均为阴性反应。损伤后进入裸区的细胞少数可呈现为GC阳性，但GC阳性反应则分布于胞核附近。染色结果还表明在星形胶质细胞下面另有一层细胞，这种细胞不为GC和GFAP抗体识别。

在实验中有时会观察到一种有纤长突起的梭形细胞(形态类似雪旺细胞)，相互间以突起相连，在损伤时通过损伤区的速度最快，其组织化学染色为GC阳性(图16)。

讨论

胚胎期脊髓细胞经过在含有血清的环境中培养4周后，可形成含有少突胶质细胞和星形胶质细胞的混合性胶质细胞。在本实验条件下，Thy1.1阳性纤维细胞和NSE阳性神经元都没有发现，表明此培养中无成纤维细胞及神经元。损伤前对GFAP及GC染色与相差显微镜观察的细胞分布相一致，表明胶质细胞纯度是可靠的。对混合性胶质细胞施以机械性划痕损伤后，损伤边缘的细胞呈现GFAP染色加深，这与有关的报道相符^［4，5］，但从损伤边缘进入损伤裸区的细胞虽有剧烈的形态变化，却并非为GFAP阳性，这一点出入意料。一般认为GFAP阳性的细胞是星形胶质细胞，其对损伤的反应快而明显，表现为GFAP升高的同时伴有细胞的增生和迁移^［6］。在体内实验表明，损伤后3d内GFAP升高达到最大，并可持续很长时间。本实验中，进入损伤区的细胞通常为GC反应阴性，偶尔可见少数细胞为GC反应阳性，但其形态与正常的少突胶质细胞相差甚远，而且这类细胞似乎分布于混合性胶质细胞的最底层，其快速伸出与回缩的突起和突起上可移动并融合膨体都使其与损伤边缘无明显形态变化的GC阳性细胞相区别。考虑到免疫细胞化学染色结果显示没有Thy1.1和NSE阳性细胞存在，则这种细胞的可能来源尚需进一步确定，可能为：1.一种反应性的星形胶质细胞，但其GFAP在损伤观察期内发生了变化，有报道在体实验中CNS损伤后星形胶质细胞的GFAP变化与细胞的肥大及增殖并非平行。2.神经元或胶质细胞的前体细胞，因为培养的是胚胎期的小鼠脊髓，各类细胞仍处于发育成熟过程中，各类前体细胞表型与成熟的细胞不同，从时间上看，E14～15d小鼠脊髓培养4周后，正相当于在体条件下星形胶质细胞从出现到基本成熟时期，同时少突胶质细胞的形成期则相当于出生后的3周，这与在培养中观