【摘要】目的为研制出能特异与P⁵³结合的单克隆抗体，使对P⁵³的检测得到更为广泛的应用。方法用PCR技术扩增编码人P⁵³N-端180个氨基酸的DNA片段并将其克隆在谷胱苷肽转移酶(GST)表达质粒P^GEX-2T中。用该重组质粒转化大肠杆菌JM109，并经异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生P⁵³-GST融合蛋白。用P⁵³-GST免疫BALB/c小鼠。常规细胞融合，间接酶联免疫吸附试验(ELISA)双筛和免疫组织化学(IHC)筛选。结果获得一株能稳定分泌抗P⁵³单抗的杂交瘤细胞株，其分泌的单抗(命名为M126)，亚类为IgG2b。用单抗M126与常用P⁵³进口单抗P_AB1801(ZYMED公司)同时对52例乳腺癌的石蜡切片标本进行IHC分析，阳性检测率分别为48.1%(25/52)和42.3(22/52)，与P_AB1801相比M126表现出更强的反应特异性，在一定程度上优于P_AB1801。结论M126可替代进口单抗P_AB1801用于P⁵³免疫组织化学研究。

EXPRESSION OF P⁵³ FUSION PROTEIN IN PROKARYOTE AND

PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY TO P⁵³

Liu Caiyun^Δ, Shou chengchao, Sun Sulian, Zhang Lei, Zeng Li^*

(The School of Oncology, Beijing Medical University, Beijing Institute for Cancer Research, Beijing;^*Institute of Urology, Beijing Medical university,Beijing)

【Abstract】 Objective The aim in this paper was to prepare anti-P⁵³ monoclonal antibody, which can specifically bind to human P⁵³, and made it widely useful in P⁵³ detection by immunohistochemistry(IHC).Methods The P⁵³ DNA fragment encoding N-terminal 180 amino acid was obtained by PCR and was cloned into P^{G EX}-2T plasmid expressing glutathione S-transferase(GST); The P⁵³-GST fusion proteins expressed by JM109 was used for immunizing BALB/c mice.Results We have raised one hybridoma strain secreting McAb to human P⁵³ (named M126); the IHC analysis of 52 praffin-embedded sections from human breast cancer with M126 and P_AB 1801 has shown that the positive immunoreactions were shown in 25 cases (48.1%) and 22 cases (42.3%) respectively; the staining of M126 was stronger and preferable to import P⁵³ McAb P_AB 1801.Conclusion M126 can be used instead of P_AB 1801 for studying immunohistochemical analysis on P⁵³ protein.

【Key words】 P⁵³ fusion protein; Monoclonal antibody; Immunohistochemistry

野生型P⁵³基因是一种抑癌基团，编码53kD的核蛋白，在正常细胞中参予细胞周期的负调节而控制细胞的增殖^［1］。正常P⁵³蛋白半衰期短不能用IHC法检测出，而突变的P⁵³蛋白因半衰期延长而导致P⁵³蛋白在细胞中的累积，很容易用IHC法检测出^［2］。Barnes等^［3］对1千多例组织学标本进行了回顾性研究，发现有40%以上的恶性肿瘤组织能见到P⁵³阳性染色，进一步研究发现肿瘤组织中P⁵³高度表达的患者其预后差。因此，用IHC法检测肿瘤组织内P⁵³蛋白表达，早期制定合理治疗方案，将有助于改善患者的预后。制备特异性强、亲和力好的抗体为检测突变的P⁵³蛋白提供了基本保证。我们就P⁵³cDNA的扩增、重组、表达、单抗的制备及在组织化学检测中的结果报告如下。

材料和方法

1.P⁵³-P^GEx-2T重组质粒的构建

根据人P⁵³cDNA序列，设计两个分别带有BamHI和EcoRI酶切位点能扩增编码N-端180个氨基酸cDNA的引物，P⁵³上游引物：5′ AACGGATCCATGTGCAATACCACCATG3′，下游引物5′ACGAATTCACCAGATAATTCATCTGA3′，PCR扩增条件为：95℃变性5min，94℃变性45s，48℃退火1min30s，72℃延伸1min30s(3个循环)，94℃变性45s,56℃退火1min30s, 72℃延伸1min 30s(30个循环)，72℃延伸10 min; 4℃冰浴。获得相应的cDNA片段，将该片段分别用BamHI/EcoRI消化，根据阅读框架，将其克隆在经酶切(BamHI/EcoRI)的P^GEX-2T表达质粒中(图1)。

图1P⁵³cDNA片段的PCR扩增及克隆

Fig.1 The amplification by PCR and the cloning of P⁵³ cDNA fragment

2.感受态细胞制备及重组质粒的转化

将冻存于-70℃的JM109菌复苏划LB板37℃过夜，次日挑选单一菌落于LB培养液中37℃振荡培养，待菌液OD₆₀₀为0.2～0.6h,5 000r/min离心10min，沉淀用1/2培养体积的4℃25m mol/LCaCl₂悬浮，冰浴30min后离心10min，沉淀用1/10培养体积的预冷CaCl₂混悬，冰浴40min，备用。将50ng重组质粒P⁵³-P^GEX-2T和0.1ml感受态JM109混合，置于冰上30min，转入42℃水浴2min，加入37℃预温的LB0.9ml，37℃缓慢轻摇45min，接种到含有氨苄青霉素的LB(LB/Amp+)培养皿中，37℃过夜。

3.融合蛋白的制备及特性鉴定

挑选几个上述LB/Amp+板中的单个菌落分别置于LB/Amp+培养液中，37℃250r/min振摇培养至OD₆₀₀约1h，加入IPTG诱导(终浓度为0.5mol/L)，不加入IPTG者为阴性对照，继续振摇1～2h。经SDS-PAGE后，将表达融合蛋白的菌落用微量碱变性法提取DNA，进行酶谱分析。提纯重组质粒P⁵³-P^GEX-2T，再进行转化、诱导，挑选表达融合蛋白量多者，进行大量扩增诱导、离心，用含1%Triton X-100的溶菌酶裂解细菌、超声破碎，取其少量及离心后的沉淀、上清行SDS-PAGE，确定融合蛋白的溶解性；大量裂解液行SDS-PAGE，用预冷的0.1mol/L KCl染色，切下融合蛋白带，电洗脱过夜，收集蛋白液，PEG浓缩，PBS透析，以BSA为标准，确定P⁵³蛋白量。用间接ELISA法测定此融合蛋白与进口单抗DO1、P_AB1801反应性。

4.抗P⁵³蛋白单抗的制备

用P⁵³-GST融合蛋白为免疫原，免疫6～8周龄BALB/c小鼠3次，每次50μg/只鼠。末次免疫1月后，腹腔注射融合蛋白50μg/鼠，3d后取脾制成细胞悬液与SP2/0细胞常规融合。分别用融合蛋白P²¹-GST及P⁵³-GST包被酶标板，间接ELISA法双筛挑选与P⁵³-GST强阳性而与P²¹-GST不反应的细胞上清再行IHC染色，将IHC染色阳性孔的细胞进行克隆，待细胞分泌抗体的能力稳定之后，制备小鼠腹水；并用间接ELISA法对抗体亚类进行测定。

5.乳腺癌石蜡切片免疫组织化学研究

采用SP法将石蜡切片常规脱蜡入水，甲醇-0.3%H₂O₂阻断内源性过氧化物酶，PBS洗2次，0.1%人血清白蛋白(HSA)封闭0.5h，每例石蜡切片分别加入自制单抗M126(杂交瘤细胞培养上清)及进口单抗P_AB1801(1：50)，37℃ 1h，或4℃过夜；PBS洗3次，加入Bio-马抗小鼠IgG(1∶500)(ZYMED公司产品)，37℃，0.5h，PBS洗3次；加入HRP-SA(1∶1 000)(ZYMED公司产品)，37℃，0.5h，PBS洗3次；加入二氨基联苯胺(DAB)0.5g/L和0.03%H₂O染色5min。苏木精复染，盐酸-酒精分色，脱水、透明、封片、镜检。进行抗原修复需在甲醇-H₂O₂之后，将片子置于pH6.0，0.01mol/L枸橼酸缓冲液中煮沸10min，再用0.1%HSA封闭，以后各步同上。

结果

1.重组质粒的构建及融合蛋白表达

图2结果表明重组质粒转化的JM109克隆经IPTG诱导后其细菌裂解液在50kD处多1条蛋白带，与P⁵³-GST的预计分子量(约48kD)相符，蛋白表达约为15mg/L菌液。从表达该蛋白的细胞中提取的质粒DNA经用内切酶BamHI/EcoRI消化鉴定，含有550bp左右大小的插入片段(图略)，表明PCR产物已克隆在P^GEX-2T中并得到表达。图2结果也显示转化细菌在IPTG诱导后经溶菌酶裂解、超声破碎，融合蛋白主要存在于经离心后的上清中，沉淀中几乎没有。融合蛋白的纯度在95%以上。所制备的融合蛋白P⁵³-GST能特异与进口P⁵³单抗有较强的反应。

图210%SDS-PAGE分析P⁵³-GST在细菌裂解液中的溶解性

胶用考马斯亮蓝染色；1.分子量标准，2，3.IPTG不诱导

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