摘要为了解神经营养素与免疫系统的关系，用免疫组织化学方法对神经营养素包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素3(NT-3)进行小鼠脾的定位研究。结果表明：3种神经营养素的免疫反应均存在于脾内，但分布特点各不相同。NGF主要分布于白髓动脉周围淋巴鞘(PALS)外层、边缘区(MZ)和红髓(RP)的巨噬细胞样和淋巴细胞样细胞；BDNF除具有与NGF相似的分布特点外，还见于脾淋巴小结生发中心的淋巴细胞样细胞；NT-3则存在于白、红髓的网状细胞样细胞。这一结果提示，脾的免疫和非免疫细胞均可能产生神经营养素，并提示不同类型的神经营养素对免疫系统有不同的作用。

神经系统的发育和存活依赖于神经营养性因子，即一类由神经元所支配的效应细胞或神经元自身所产生的蛋白质。先后发现的神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3，4/5(NT-3,4/5)是一类在分子结构、受体类型、生物功能等方面相类似的因子，它们共同组成神经营养因子中的亚家族，合称神经营养素。

神经营养素除存在于神经系统之外，还广泛分布于全身其他器官并参与一些除神经营养之外的生理活动。有报道，NGF具有促进淋巴细胞增殖和分化^［1，2］、调节T淋巴细胞白介素-2受体的表达等作用^［3］。新近研究发现NGF、BDNF、NT-3/4等神经营养素mRNA存在于胸腺和脾^［4］。因而，做为一种有可能在神经-免疫调节环路中起作用的因子，神经营养素正在引起人们的注意。但有关这些因子在免疫器官的定位尚不清楚。本研究应用免疫组织化学方法对以上3种神经营养素在脾内的定位进行初步研究，为揭示其在免疫系统的功能作用提供形态学基础。

材料和方法

1. 动物及组织处理

采用7～8周的雄性BALB/c小鼠15只，体重20～25g。动物以异戊巴比妥钠麻醉，经左心室灌注生理盐水10ml，继而灌注4℃的含4%多聚甲醛、0.01%戊二醛、0.2%苦味酸的磷酸缓冲液(0.1mol/L PB)，pH7.4。10min后取出脾，以不含戊二醛的上述固定液于4℃再固定12～16h。以与脾长轴垂直的方向将脾分为4等份，取靠中线的一块自脾门向被膜方向做振动切片(厚30μm)，收集所有切片于0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)中。

2. 免疫组织化学

特异性抗NGF、BDNF、NT-3多克隆抗体由美国Santa Cruz.公司提供(工作浓度1∶500)。染色中洗涤切片用0.01mol/L PBS(pH7.4)。切片先在0.01mol/L PBS中浸泡2～3h以去掉残留的固定剂，用甲醇+0.1%H₂O₂处理15min以消除内源性过氧化物酶活性，PBS洗(5min×3)，用0.01mol/L Tris缓冲液(TBS)稀释的正常羊血清封闭1h，直接进入由抗体稀释液(含1%牛血清白蛋白、0.2%TritonX-100、0.08%叠氮钠的0.01mol/L Tris缓冲液，pH7.4)稀释的特异性抗体中孵育36～72h。PBS洗(5min×3)，入羊抗兔生物素化IgG(丹麦Vector公司，1∶500)37℃孵育1～2h，PBS洗(5min×3)，入ABC复合物(丹麦Vector公司，1∶500)37℃孵育1h，PBS洗(5min×3)。切片经短暂过蒸馏水后进入含0.05%DAB、2.5%硫酸镍铵、0.01%H₂O₂的0.1mol/L醋酸缓冲液(pH6.2)中呈色10～15min。蒸馏水洗(15s×2).PBS与1%明胶混合液中贴片，部分切片以1%中性红复染。室温晾干，100%酒精脱水、二甲苯透明，树胶封片。

3. 对照实验

分别以PBS或正常兔血清替代一抗，以及以PBS替代二抗同步进行染色。

结果

1. NGF免疫反应性细胞的分布

NGF免疫反应性细胞主要分布于脾边缘区(MZ)和红髓(RP)，少数细胞散在于白髓动脉周围淋巴鞘(PALS)的外层或PALS与淋巴小结之间。而PALS内层和淋巴小结内几乎无阳性细胞(图1)。NGF免疫反应性细胞与血管关系密切，它们围绕在白髓中央动脉和红髓内小血管周围(图2)。NGF阳性细胞为大、小两种，分别属于巨噬细胞样和淋巴细胞样细胞。两种细胞胞浆均呈免疫染色，胞核呈阴性。较大的细胞形态不规则、边缘不整齐、胞浆丰富、胞核较小。较小的细胞为圆形、胞浆少、胞核相对较大，居中或偏向一侧(图3)。

图1示边缘区(MZ)和红髓(RP)NGF免疫反应性细胞，少数细胞散在于白髓动脉周围淋巴鞘(PALS)内×100

2示白髓中央动脉周围(短箭头)和RP小血管周围(长箭头)NGF免疫反应性细胞×40

3示PALS内NGF免疫反应性巨噬细胞样细胞(长箭头)和淋巴细胞样细胞(短箭头)×400

Fig.1 NGF immunoreactive(IR)cells distributed in marginal zone(MZ) and red pulp (RP) of spleen,with a small number of cells scattered within the periarterial lymphocyte sheath (PALS) of the white pulp.×100

Fig.2 NGF-IR cells around the central artery of white pulp(arrow head) and blood vessels of red pulp (arrows).×40

Fig.3 NGF-IR macrophages-like (arrow) and NGF-IR lymphocyte-like (arrow head) cells in the PALS.×400

2. BDNF免疫反应性细胞的分布

BDNF免疫反应细胞在MZ和RP的分布特点与NGF免疫反应细胞相似。即分布于PALS外层、MZ和脾索(图4)。另外，BDNF免疫反应性细胞还散在于脾淋巴小结生发中心(G)内。这些阳性细胞呈现淋巴细胞的特征。胞浆呈免疫反应性，胞核呈阴性(图5)。白髓内阳性细胞的免疫染色普遍较边缘区和红髓者浅，少部分淋巴小结内未见免疫反应性细胞。BDNF免疫反应性细胞与脾血管无明显关系。

图4示MZ和RP内BDNF免疫反应性细胞×100

5示脾淋巴小结生发中心(G)内BDNF免疫反应性淋巴细胞×200

Fig.4 BDNF-IR cells located in MZ and RP. ×100

Fig.5 BDNF-IR lymphocytes located in the germinal center (G) of splenic lymph node. ×200

3. NT-3免疫反应性细胞的分布

NT-3免疫反应性细胞广泛分布于白髓和红髓。(1)白髓：根据形态不同将免疫反应性细胞分为两种。一种细胞数量较多，于PALS内部均匀散在(图6)，在PALS周边呈单层整齐排列(图8)。胞核、胞浆均呈免疫反应性，而且胞核的染色强于胞浆(图6)。油镜观察可见阳性胞核周围有染色稍淡的胞浆，胞浆多带有突起(图7)。另一种细胞数量较少，主要分布于脾淋巴小结内(图6)，圆形或椭圆形，边缘整齐，胞浆丰富。(图9)。(2)红髓：阳性细胞常集中成群，胞浆呈免疫反应性(图10)。各级动、静脉分支和脾血窦的内皮细胞均呈阳性反应(图11)。另有一些大小不等的细胞成群分布于血管附近，或胞浆呈阳性或胞浆、胞核均呈免疫反应性(图11)。

图6示PALS和脾淋巴小结的断面，两者之间界限不清，中央动脉偏于一侧，中央亮区为G。许多NT-3免疫反应性细胞散布于PALS和脾淋巴小结中，G内阳性细胞很少。中性红复染×200

7示PALS内NT-3免疫反应性细胞，胞核与胞浆免疫染色均呈阳性，箭头示NT-3免疫反应性细胞的胞浆突起×1 000(油镜)

8示PALS及其周边的NT-3免疫反应性细胞，MZ阳性细胞很少，中性红复染×400

9示G内NT-3免疫反应性细胞，圆或椭圆形，无胞浆突起×1 000(油镜)

10示红髓内聚集成群的NT-3免疫反应性细胞×400

11示NT-3免疫反应性内皮细胞，血管周围可见胞浆着色(箭头)和胞浆胞核均着色(三角)的两种细胞×400

Fig.6 A profile of PALS and splenic lymph node,the boundary between them is not clear.A central artery could be seen located in one side.The lighter area in the central was G.A lot of NT-3-IR cells scattered in PALS and splenic lymph node,while less NT-3-IR cells in G.Counterstained with neutral red.×200

Fig.7 NT-3-IR cells in the PALS which were immunohistochemically stained both in nuclear and cytoplasm,arrows show the cytoplasmic processes of NT-3-IR cells. ×1 000(oil)

Fig.8 NT-3-IR cells distributed in the PALS and its peripheral region.Only a few positively stained cells were found in MZ.Counterstained with neutral red. ×400

Fig.9 NT-3-IR cells in the germinal center which are round or ellipse in shape and have no cytoplasmic processes.<