摘要为了解脾交感神经在免疫功能增强时的形态变化，用免疫组织化学方法观察了BALB/c小鼠脾内生长相关蛋白样免疫反应(GAP-43-LI)性神经在结核菌素衍生蛋白(PPD)诱发的免疫反应高峰期数量和分布的变化。结果显示，动物在接受两次PPD注射(21d+7d)后，脾GAP-43-LI神经纤维密度明显增加并伴有分布和形态的变化。于对照动物，脾GAP-43-LI神经纤维主要分布于血管周围，少量伸入动脉周围淋巴鞘的脾基质中，而在免疫刺激的动物，不仅血管周围的神经纤维明显增多，动脉周围淋巴鞘外层、边缘区和红髓等免疫应答活跃的部位也出现许多神经纤维。神经纤维分支和纤维上膨体明显增多。以上结果提示：免疫应答中脾神经成分发生活跃的结构重塑，这些变化有可能与神经的免疫调节功能有关。

近年来的大量研究事实证明，神经、内分泌和免疫系统之间存在着相互影响和相互调节。免疫细胞产生的多种细胞因子可作为信使将免疫反应的信息传递给中枢神经系统，后者将信息整合后通过目前公认的神经内分泌和自主神经两大途径对免疫功能进行调节。初级和次级免疫器官的淋巴组织中神经纤维的发现为研究两大系统的功能联系开辟了广阔的视野。作为机体中神经系统与免疫系统直接接触的场所，脾的神经支配以及神经与脾免疫功能之间的关系得到了大量的研究。已知脾交感神经不仅仅是传统意义上的血管支配神经，它们在脾实质中也广泛分布；α、β肾上腺素受体及神经肽受体广泛存在于脾免疫细胞之上，并能介导相应激素对免疫细胞功能的影响；儿茶酚胺在体外、体内均能调节淋巴细胞的功能及去除交感神经支配对于脾的免疫功能产生极大影响^［1，2］等事实证明，免疫器官的神经支配是神经免疫调节的重要途径之一。

以上多数工作是通过刺激或损毁交感神经来观察免疫功能改变的，而通过改变免疫状态来观察神经成分变化的研究很少。有报道老年大鼠脾交感神经的密度下降，间接表明神经支配密度与免疫功能的强弱成正比。而免疫功能增强的状态下脾交感神经密度有无改变尚未见报道。本实验中我们以生长相关蛋白(GAP-43)免疫反应作为脾交感神经纤维标记，研究在抗原刺激后抗体产生最高峰期BALB/c小鼠脾内神经的改变，借以了解脾神经在免疫功能增强时的可塑性，为深入探讨脾交感神经的免疫调节机理提供依据。

材料和方法

1.动物和实验处理

选7～8周龄，体重20～25g的雄性BALB/c小鼠18只，实验组和对照组各6只，另有6只用于探索免疫方案的前期实验。动物饲养在恒温、恒湿、定期消毒的环境中，饲以小鼠专用块食和清水。实验组动物接受2次免疫，抗原为结核菌素衍生蛋白PPD(中国药品生物制品鉴定所)。初次免疫时将抗原与福氏完全佐剂(Sigma公司)混合，每只动物腹腔注射500μl，含PPD 30μg。动物存活21d后接受第2次免疫注射，这次将抗原溶于消毒生理盐水，每只动物腹腔注射500μl，含抗原30μg。7d后将动物处死。对照组动物在相同的时间点接受2次消毒生理盐水腹腔注射，每只500μl,此实验方案根据前期实验组尾静脉取血、间接ELISA法测定血清中抗PPD特异性抗体的滴度而确定。在初次免疫后第9d有一抗体高峰，追加免疫后第7d出现第2个更高的峰(图1)。

2.组织处理和免疫组织化学

动物全部以1%戊巴比妥钠深麻(30mg/kg i.p.)，经主动脉灌注生理盐水10ml,继而灌注4℃的4%多聚甲醛-磷酸缓冲溶液10min。取出脾浸入相同固定液中后固定8～12h,称脾重，转入含20%蔗糖的磷酸缓冲液中4℃下浸泡12h。沿与脾长轴垂直的方向将脾分为4等份，取靠中线的一块自脾门向被膜方向做冰冻切片(厚30μm)，每5张切片中收集1张于0.01mol/L,pH7.4的磷酸钾盐缓冲液(KPBS)中。切片用甲醇+0.1%H₂O₂处理15min，以消除内源性过氧化物酶活性，0.05mol/L Tris-盐酸缓冲液(TBS)洗(5min×3)，浸入由TBS稀释的2%牛血清白蛋白(BSA)中封闭60min，直接进入由含2%BSA、1.8%叠氮钠、0.1% Tween-20 的双倍盐 Tris-盐酸缓冲液(TBS₂T)稀释的特异性绵羊抗GAP-43 IgG(1∶1 000)中4℃下孵育36～48h，特异性抗体由美国哈佛大学 Benowitz教授惠赠。孵育结束后，切片在TBS₂T中洗30min,入TBS₂T稀释的羊抗兔生物素化IgG(Sigma公司，1∶200)室温孵育120min,TBS₂T洗(10min×3)，入TBS稀释的ABC复合物(Sigma公司，1∶200)室温孵育100min,TBS洗(5min×3)。切片进入含0.05%DAB，2.5%硫酸镍铵，0.01%H₂O₂的0.1mol/L,pH6.2醋酸缓冲液中呈色10～15min。贴片，必要时以1%中性红复染。室温晾干，100%酒精脱水、二甲苯透明，DPX封片。行空白对照实验。抗体的特异性检验采用吸收实验，详见文献［3］。

3.定量分析

对每例动物所有的脾切片逐张进行分析。在10倍显微镜下，从每张切片的左上角开始，向下移动视野，每隔4个视野取1个作分析用。为确保相邻上下扫描的视野没有重叠，两排之间相隔一视野的宽度。在Camera Lucida(Nikon,Japan)下，用统一粗细的笔画出白、红髓的轮廓和其中的阳性神经纤维。用Leica 570℃图像分析仪测定每个视野中白髓和红髓的面积和其中神经纤维的长度。计算出单位面积内神经纤维的总长度。

4.抗PPD特异性抗体的检测

采用间接ELISA法，其程序如下：进口ELISA板包被抗原(PPD 10mg/L)4℃过夜，1%BSA 37℃封闭1h，加入从1∶20开始稀释的免疫小鼠血清，37℃孵育1h，加HRP标记的羊抗鼠抗体(美国Sigma公司，1∶1 000)37℃，1h，四甲基联苯胺(TMB)呈色，2mol/L硫酸终止反应，ELISA读数仪(型号)检测结果。以上各反应步骤之间均以PBS Tween-20洗涤。

结果

脾重测量结果显示免疫应答动物脾的重量明显高于对照组(P＜0.01)，除镜下发现生发中心增多以外，脾的一般结构未出现明显变化。

ELISA检测结果表明，血中抗PPD抗体滴度于初次免疫后第9d达到第1个高峰，追加免疫后第7d达到第2个且更高的高峰(图1)。

对照动物脾内GAP-43-LI神经纤维分布于中央动脉和其分支周围，同时有少数纤维伸入动脉周围淋巴鞘(PALS)的淋巴实质中，但一般只到达内层，偶见少数神经纤维分布于边缘区(图2a,2b)。在接近脾门的PALS中阳性神经纤维分布较密集。红髓中可见到少量细而短的GAP-43-LI纤维。大多数神经纤维上膨体较少。

免疫刺激动物脾内血管周GAP-43-LI神经丛密度明显增大(图3a，3b)，许多血管周神经丛的神经纤维上出现大量膨体(图3c)。自血管周神经丛伸向PALS 的神经纤维明显增多(图3d)，PALS外层、PALS与边缘区交界区阳性神经纤维增多，有些神经纤维伸入边缘区(图3e～3g)。另一明显变化是神经纤维增粗、膨体增多(图3g,3h)。红髓内神经纤维密度也明显增加，带有膨体的神经纤维位于红髓髓索或密集地围绕在末梢小动脉的周围(图3i)。虽然接受免疫的动物脾内生发中心增多，但生发中心内几乎无神经分布。定量分析结果显示，PPD免疫组动物脾红髓和白髓内GAP-43-LI神经纤维密度明显高于对照组(图4)。于实验组和对照组的个别动物可见少数性质不明的GAP-43-LI细胞，其数量多少与免疫刺激无任何关系。

图2对照小鼠脾抗GAP-43抗体染色结果，中性红复染。

2a示GAP-43-LI血管周神经丛，有小量神经纤维伸入动脉周围淋巴鞘(PALS)的实质中。CA.中央动脉PALS.动脉周围淋巴鞘MZ.边缘区标尺示40μm

2b示阳性神经纤维主要见于PALS 的内层，偶见于边缘区。神经纤维较细，膨体和分支较少标尺示20μm

Fig.2 The spleen of contral mouse spleen stained with anti-GAP-43 IgG,counter stained with neutral red.(2a).GAP-43-LI nerve plexus around the central artery,with a small amout of fibers extending to the parenchyma of the PALS.CA:central artery,PALS:periarterial lymphocyte sheath,MZ:marginal zone.Bar=40μm.(2b):immunoreactive nerve fibers in the inner part of the PALS,which occasionally can be seen in the marginal zone.Nerve fibers are thin,with a small amount of varicosities and branches.Bar=20μm

图3PPD免疫小鼠脾抗GAP-43抗体染色结果，中性红复染。

3a，3b示浓密的血管周神经丛，神经纤维向PALS的实质中伸展。标尺示10μm

3c示血管周神经纤维上的大量膨体标尺示10μm

3d示自动脉周神经丛伸向PALS分支丰富的神经纤维标尺示20μm

3e～3g示PALS、边缘区的阳性神经纤维标尺示20μm(3e),标尺示10μm(3f,3g)

3h示PALS 中带有不同大小膨体的神经纤维标尺示10μm

3i示红髓中分布于末梢小动脉周围(↑)和髓索内(Δ)的神经纤维标尺示