摘要为研究福尔马林实验动物行为反应与脊髓内P物质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)之间可能的相互关系，应用免疫组织化学方法结合图像分析技术，对福尔马林实验大鼠不同时程的脊髓后角浅层内SP、CGRP的含量进行了半定量分析，并与大鼠的行为反应分期进行了比较。结果显示：脊髓后角浅层内SP和CGRP的含量在福尔马林实验后的第1期反应(0～5min)时迅速降低；在间歇期(5～20min)仍持续降低，在15min达最低值；间歇期后进入第2期反应(30～60min)时，逐渐开始缓慢恢复，60min后恢复至正常水平，并开始逐渐增高，于90min达最高值。之后逐渐回落，在12～24h又恢复至正常水平。结果提示：福尔马林实验引起的大鼠两期伤害性反应可能与伤害性信息传递引起的SP和CGRP在脊髓后角浅层内的释放有密切关系。

福尔马林刺激模型自Dubuisson和Dennis^［1］在1977年建立以来，作为一个非常可靠的痛实验模型一直被人们所采纳。在该实验过程中，大鼠主要出现抬起被刺激肢体，舔、咬被刺激部位，跳跃和肢体震颤等行为反应，并依时间顺序而发生改变，称之为两期伤害性反应(bi-phasic nociceptive response)。第1期行为反应在刺激后立即出现，持续约5min。之后动物处于安静状态，称之为间歇期。第2期行为反应在刺激20min后开始出现，持续约30～60min，行为反应随时间逐渐减弱。过去，人们对福尔马林实验所出现的两期伤害性反应的研究多集中于外周感受器的变化^［2～4］，而对其中枢机制的研究较少，尤其缺乏与伤害性信息传导密切相关的神经活性物质在两期伤害性反应中作用的研究。

P物质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)是目前公认的与伤害性信息传导密切相关的两种神经活性物质^［5～7］，含有它们的初级传入纤维及终末主要终止于脊髓的后角浅层(Ⅰ～Ⅱ层)，并与接受伤害性刺激信息的投射神经元形成直接或间接的联系，说明它们在伤害性刺激实验引起的动物行为反应中可能起着至关重要的作用。因此，本实验应用免疫组织化学方法检测了给予大鼠福尔马林刺激后不同时程的脊髓后角浅层内SP和CGRP的含量变化，以期为研究SP和CGRP在福尔马林实验两期伤害性反应中的作用提供证据。

材料和方法

用200～250g成年SD大鼠20只。按给予福尔马林刺激后存活时间的不同，分为9个实验组(5、15、30、60、90min和2、12、24、48h)每组2只；另2只为对照组(30min)。

实验组：动物安静环境中饲养1d后，在乙醚麻醉下，于右后足跖部皮下注入5%福尔马林150μl。分别在上述9个时间点灌注取材。

对照组：同样条件下，于右后足跖部皮下注入150μl生理盐水，30min后灌注取材。

灌注时动物在戊巴比妥纳(100mg/kg,腹腔注射)深麻下，经升主动脉插管，先以生理盐水冲净血液，随即灌注含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB，pH7.4)500ml。取脊髓L_4～6节段置于上述固定液中后固定约3h(4℃)，再浸于含30%蔗糖的磷酸缓冲液中过夜(4℃)。冰冻连续横切片，片厚40μm，用ABC法进行免疫组织化学反应。具体步骤如下：每组切片经PBS(0.01mol/L，pH7.4)充分漂洗后，分为2套分别依次移入：(1)兔抗SP血清(1∶5 000，Amersham)或兔抗CGRP血清(1∶8 000，Incstar)中37℃孵育30min，然后移于4℃冰箱中孵育48h(抗体用含3%正常山羊血清和0.2%Triton X-100的0.01mol/L PBS配制)；(2)结合生物素的羊抗兔IgG (1∶200, Vector, 稀释液同上)中室温下孵育3h；(3)结合链卵白素的HRP(1∶200，Vectro，用0.01mol/L PBS稀释)中室温下孵育1h。最后切片用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵法呈色15min。以上各步骤间均用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次10min。为尽量减少免疫染色操作过程中的误差，尤其是DAB呈色时对结果的影响，所有各组切片均在同一条件下孵育、呈色。呈色的切片裱于涂有明胶的载片上，室温干燥，梯度酒精脱水，二甲苯透明，DPX封固。光学显微镜观察、摄片，并进行图像分析。

每组大鼠随机选取10张脊髓切片，用图像分析仪(MIAS-300型)检测脊髓后角Ⅰ、Ⅱ层内的SP、CGRP样免疫反应阳性纤维及其终末的光密度。图像分析时，以非刺激侧同一区域内某一物质的平均密度为100(正常对照)，对刺激侧该区域内相应物质的相对密度进行测定，并进行统计学分析。

图2福尔马林实验中大鼠同侧脊髓后角浅层内SP样、

cGRP样免疫反应性产物相对密度的时程变化.

fig.2 Time course showing relative densities of SP-LI and CGRP-LI in the superficial

layers of the spinal dorsal horn in therat on the ipsilateral side during formalin test.

结果

1.注射福尔马林后大鼠的行为反应

Dubuisson和Dennis^［1］将对伤害性刺激引起的大鼠行为反应的强度进行了分级：第1级行为反应表现为减轻被刺激肢体承重，第2级行为反应表现为完全提起被刺激肢体，第3级行为反应表现为舔、咬被刺激肢体及被刺激肢体的颤抖。本实验所观察的实验组各动物均出现完全提起、舔、咬被刺激肢体，肢体的颤抖，跳跃，竖毛等行为反应，属于第3级。在注射福尔马林后的长时程存活实验组大鼠(刺激后存活时间大于1h)均观察到了完整的两期伤害性的应，与Dubuisson和Dennis^［1］先前描述的相一致。而在较短时程存活的实验组大鼠仅观察到第1期、间歇期或部分第2期的行为反应。即：5min组只出现第1期行为反应；15min组出现了第1期行为反应和间歇期；30min以后各实验组除表现有第1期行为反应和间歇期外，约在20min开始出现第2期行为反应。本实验所观察到的各实验组大鼠的行为反应随时间逐渐减弱，出现的频率逐渐减低。

对照组动物无上述行为变化。

2.注射福尔马林后脊髓后角浅层内SP、CGRP的变化

2.1SP：光镜下SP样免疫反应性的纤维和终末密集分布于脊髓后角Ⅰ、Ⅱ层。在给予大鼠后足跖部皮下福尔马林刺激后，刺激侧脊髓后角浅层内SP样免疫反应性产物的含量与对照侧相比发生了明显的变化。其中在5min至1h的4组不同存活时间的实验组大鼠中，刺激侧脊髓后角浅层内SP样免疫反应性产物的含量下降(图1a,a')。尤以15min组大鼠最为明显。在1.5h和2h组实验大鼠中，刺激侧SP样免疫反应性产物的含量增高(图1c,c')。但12h后的各实验组大鼠中脊髓后角浅层内SP样免疫反应性产物与对照侧基本相似。对各实验组大鼠脊髓后角浅层内SP样免疫反应性产物的相对密度进行了统计学处理，结果表明：5min至1h和1.5h至2h的各实验组的大鼠刺激侧脊髓后角浅层内SP样免疫反应产物的相对密度与对照侧之间存在明显差异(P＜0.05)，而12h至48h的各实验组的大鼠刺激侧脊髓后角浅层内SP样免疫反应阳性产物的相对密度与对照侧之间未见明显差异(P＞0.05)。此外，对照组各动物两侧脊髓后角浅层内SP样免疫反应性产物的含量基本相同。经统计学处理，生理盐水注射侧脊髓后角浅层内SP样免疫反应性产物的相对密度与非注射侧之间未见有明显差异(P＞0.05)(图2)。

每组中L_4～6各节段切片的结果均呈现类似的改变，未见明显差别。

2.2CGRP：CGRP样免疫反应性的纤维和终末在L_4～6各节段的分布与SP大体一致，主要分布于脊髓后角Ⅰ和Ⅱ层。给予伤害性刺激后的变化趋势(图1b,b'，d,d')和图像分析结果也与SP相似(图2)。

综上可以看出，在给大鼠后足跖部皮下福尔马林刺激后，刺激侧脊髓后角浅层内SP和CGRP样免疫反应性产物的含量经历了一个先迅速下降、后又升高、再缓慢恢复的过程。

讨论

过去，对福尔马林实验产生两期伤害性反应的研究多集中于外周机制^［2～4］，并认为产生第1期反应可能是由于福尔马林直接刺激了外周伤害性感受器所致^［2］，而第2期反应则有组织胺、5-羟色胺、前列腺素和缓激肽的参与，与外周炎症反应有关^［3,4］。尽管这些研究从一个侧面加深了对福尔马林实验动物两期伤害性反应的认识，但这些研究显然忽略了初级传入纤维的中枢端所释放的神经递质和脊髓在这一过程中的作用。

众所周知，伤害性信息引起的行为反应是通过简单的反射和有上位脑结构参与的复杂反射完成的。其中初级传入纤维将伤害性信息传递至中枢是完成这一反应过程的必需环节。初级传入纤维的终末是通过释放递质，引起中间神经元或投射神经元的兴奋，从而完成伤害性信息传递的。因此，初级传入在福尔马林实验中对引起两期伤害性反应起着重要的作用。已有研究表明，福尔马林注射于大鼠后肢皮下2h后，刺激侧脊髓后角浅层内一些神经活性物质的含量增加，提示伤害性刺激可能引起这些神经递质的合成增多^［10］。但这些研究没有进行全时程动态观察，也未将其改变与福尔马林引起的两期伤害性反应结合起来进行分析。

本实验发现福尔马林刺激后，大鼠脊髓初级传入纤维及终末内SP和CGRP含量的时程变化与其行为反应的时程变化存在密切关系。因而推测：在福尔马林刺激后5min内，SP和CGRP急剧大量释放^［8,9］，将伤害性信息传入脊髓，从而产生了第1期行为反应。在刺激后5<