摘要为研究P物质激活的下丘脑大细胞神经分泌神经元及其分布，将P物质注入大鼠侧脑室，用Fos癌蛋白免疫组织化学结合催产素或加压素抗血清免疫组织化学的双标记法，检测了下丘脑各大细胞神经分泌核区被激活的催产素及加压素免疫反应性神经元。结果表明：Fos免疫强反应性的神经元主要见于第三脑室周围区及室旁核，在视上核及其他下丘脑大细胞神经分泌核区仅见到少数至极少数Fos免疫反应性神经元。Fos和催产素或加压素的免疫双染色神经元主要见于第三脑周围区，由于第三脑室周的加压素样神经元较少，因此在该区域我们见到的主要为中等至较多数量的Fos和催产素免疫双染色神经元，仅有少数的Fos和加压素免疫双染色神经元。室旁核的Fos免疫反应性神经元主要分布于室旁核的小细胞部，虽与催产素及加压素免疫反应性神经元的分布区有部分重叠，但该核区却仅见到少数Fos和催产素或加压素的免疫双染色神经元。此外，在视上核、背内侧副核也可见到少数Fos和催产素或加压素的免疫双染色神经元。本研究中将P物质注射入侧脑室后诱导的Fos阳性表达的催产素及加压素样神经元在下丘脑的分布与该区域P物质样传入纤维的分布不完全吻合，但与该区域P物质样受体的分布基本吻合。以上研究结果提示，在下丘脑水平P物质对催产素及加压素样神经元功能的调节，可能主要通过调节部分第脑室周催产素及加压素样神经元及少数视上核、室旁核及其他大细胞神经分泌核区神经元的功能活动而施的。

P物质已确定为哺乳动物中枢神经系统的重要递质，在神经系统的许多机能活动中起重要作用^［1］。目前已有的研究表明，P物质免疫反应性物质存在于下丘脑多个核区的神经纤维及终末内^［2~3］,而且P物质可影响下丘脑大细胞神经分泌系统催产素及加压素样神经元的分泌活动^［4~6］。然而，催产素及加压素样神经元存在于下丘脑的多个神经分泌核区，P物质究竟通过影响哪些神经分泌核区的神经元而实施对催产素及加压素神经元分泌活动的调控，不同的研究说法不一(参看综述)^［7］，而且缺乏形态与功能相结合的研究证据。本实验用对神经元功能活动进行细胞定位的Fos技术^［8,9］，研究了P物质激活的下丘脑大细胞神经分泌神经元及其分布。Fos技术是利用神经元受到某种兴奋性刺激时其c-fos癌基因的表达急剧增加，合成的Fos癌蛋白堆积于胞核中的特点。用原位杂交法或抗体免疫组织化学法在脑切片上染出受兴奋的神经元^［8,9］。本实验采用免疫组织化学方法，并进一步用Fos和催产素或加压素免疫组织化学双染色方法研究了此双重免疫标记的分布，我们对P物质对催产素及加压素样神经元活动调节的可能性进行了探讨。

材料和方法

实验用成年雄性SD大鼠8只，体重180～200g。1%戊巴比妥钠辅以846(第四军医大学出品)麻醉，在无任何疼痛反应条件下进行侧脑室注射，用微玻管(尖端直径5～10μm)，于Bregma点向后约1.0mm，向右约1.5mm,将5～10g/5L P物质(Sigma)注入侧脑室，该液以无菌生理盐水配制。4～5h后，将动物再次深麻醉，并经左心室依次灌入生理盐水50ml,4%多聚甲醛700～800ml(4℃下，1.5h),及20%蔗糖液100ml,立即取脑，将鼠脑浸入蔗糖液中，4℃下24h。下丘脑连续冠状冰冻切片，厚50μm，将切片收集于0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，随后用ABC法进行如下免疫组织化学染色：(1)Fos抗体免疫组织化学法，将切片入兔抗Fos血清(1∶1 000，Oncogene Sci),孵育了3d(4℃)，随后依次进入生物素化羊抗兔IgG(B-IgG,1∶400,Sigma)和ABC(1∶400,Sigma)各孵育3～4h(室温)。继之用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵法呈色^［10］，结果免疫产物显为黑色。将其中1/3切片贴片，作为Fos单染色结果进行观察。

(2)将另2/3切片继续进行Fos/催产素或Fos/加压素免疫双染色，方法如下：将用Fos抗体染色后的切片入兔抗催产素血清(1∶3 000,WatPa)或兔抗加压素血清(1∶3 000,WatPa)孵育了3d(4℃)，随后依次进入羊抗兔B-IgG(1∶400,Sigma)和ABC(1∶400,Sigma)中各孵育3～4h，常规洗片，最终以单纯DAB呈色法将催产素或加压素免疫反应产物显为棕黄色。

对照组动物分2组，1组动物(1例)在侧脑室内注入5μl生理盐水后按上述实验组方法进行Fos免疫组织化学染色。另1组(2例)则用过量催产素或加压素抗原预吸收催产素或加压素抗血清后，进行与实验组相同的催产素或加压素免疫染色。

结果

在侧脑室内注射P物质的动物其下丘脑视前区、室周部及室旁核小细胞部和部分大细胞部可见到较多的Fos阳性标记，此外，视上核及背内侧副细胞群的大细胞神经分泌核区亦见到少数Fos阳性标记。虽然下丘脑的一些非催产素及加压素神经分泌核区，如弓状核也出现Fos阳性标记，但将不对这些脑区或核团进行详细描述。我们仅对注射P物质后下丘脑室旁核、视上核及各大细胞神经元副核群的Fos表达进行描述及探讨。

大鼠下丘脑室旁核可分为多个亚核，在本研究中我们采用Swanson和Kuyper的划分命名法^［11］，其中包括3个大细胞部(前、内、后部)及5个小细胞部(前、内、背、外和室周部)。在相当于小细胞室周部的区域，根据鞠躬等^［12］的免疫组织化学研究，本研究将该区单列为第三脑室周区加以描述。侧脑室内注射P物质后，在第三脑室周围区可见到密集的Fos阳性标记(图1)，而且该核区有中等至较多数量的Fos/催产素双重免疫标记细胞(图2)计数约169×3个；可见染成黑色的Fos阳性胞核与棕黄色的催产素阳性胞浆对比很明显。由于第三脑室周区加压素样免疫反应性神经元相对较少，所以该核区仅见到少数Fos与加压素免疫双染色神经元(图3)，计数约9×3个。在室旁核小细胞部及部分后大细胞部的神经元胞核呈Fos免疫强反应性(图4)，但在Fos/催产素及Fos/加压素免疫双染色的切片上，虽然Fos及催产素或加压素免疫单染色的神经元均很多，而且Fos免疫反应性神经元与催产素或加压素免疫反应性神经元的分布区域呈部分重叠分布态势，然而该核区较少见到Fos与催产素或加压素双重染色的神经元(图5，6)，计数约：Fos/催产素12×3个，Fos/加压素7×3个。此外，在下丘脑视上核及背内侧副核的催产素及加压素神经分泌核区仅见到少数Fos与催产素或加压素免疫双染色的神经元(图7)，其中，视上核计数约：Fos/催产素26×3个，Fos/加压素；9×3个；背内侧副核约：Fos/催产素3×3个。在其他大细胞神经分泌副核区极少见到这两种双染色的神经元。

在侧脑室内注射生理盐水的动物，下丘脑各核区内均未见到Fos阳性细胞。用被催产素或加压素抗原吸收过的催产素或加压素抗血清孵育切片后，下丘脑各催产素及加压素神经分泌核区内未见到催产素或加压素免疫反应性标记。

讨论

c-fos是一种存在于正常神经元胞核内的原癌基因，可被多种刺激诱导而快速表达^［8，9］。当由c-fos原癌基因在胞浆内翻译合成的Fos癌蛋白被快速转运到胞核时，与癌蛋白Jun结合成Fos-Jun异质二聚体复合结构，能调节特定目的基因的转录^［8，9］。从此角度来看，本实验显示的侧脑室内注射P物质后，下丘脑第三脑室周围区有较多Fos/催产素双标记细胞，少数Fos/加压素双标记细胞，而且视上核，室旁核及背内侧副细胞群也见到少数Fos/催产素及Fos/加压素双标记细胞，提示P物质可能经某种途径激活这些催产素，加压素神经元的c-fos癌基因表达，进而促使催产素和加压素的合成或分泌。在Fos/催产素及Fos/加压素双标记切片上见到的第三脑室周及室旁核内亦存在较多Fos阳性单标记细胞提示，其他非催产素及加压素神经肽或递质基因也是c-fos癌基因激活的目的基因，在此文中不多加探讨。

我们的研究结果与以前一些研究的关系如何?虽然许多免疫组织化学及放射自显影的研究表明P物质及P物质免疫反应性神经纤维末梢广泛分布于下丘脑室旁核、视上核及各神经分泌副核，它们在这些核区的分布为中等含量^{［2，3，13］}。然而P物质受体的研究则表明，在下丘脑的各催产素及加压素神经分泌核区仅第三脑周的室周核区的胞体及树突有中等密度的P物质受体的分布，而视上核、室旁核及其他大细胞神经分泌核区的P物质受体则为极低密度^{［13，14］}，表明在下丘脑多个催产素及加压素神经分泌核区P物质样传入纤维及其受体的分布不匹配(mismatch)。我们将P物质注入侧脑室后主要引起第三脑室周中等至较多数量催产素样神经元Fos的阳性表达及少数加压素样神经元Fos的阳性表达，而其他神经分泌核区较少或极少见到催产素及加压素样神经元有Fos阳性表达的结果，与P物质受体在这些核区的分布基本相吻合。由此可见，将兴奋性传入神经末梢所含的递质/调质注入动物的侧脑室或循环系统，视其能否促使这些末梢所在区域细胞的Fos癌基因的表达，进而判定传入神经纤维末梢与靶细胞间有无不匹配(mismatch)的分布，这不失为一种值得一用的方法。尽管这些注入脑室或循环系统的递质/调质亦可能对靶细胞有间接的作用，尚需视具体情况具体分析。

已有许多研究表明，脑室注入P物质可引起催产素及加压素的释放^［4～6］，血循环系统内引入P物质可增加下丘脑-神经垂体系统的活动^［15］。在下丘脑P物质究竟可影响哪些催产素及加压素神经分泌核区神经元的活动?Clarke等^［5］电生理的研究显示脑室内注入P物质可引起视上核催产素或加压素神经元活动的兴奋性或有时为抑制性的效应。我们的研究则首次从形态与功能相结合的角度证实了脑室系统内注入P物质主要可激活第三脑室周的催产素样神经元和少数加压素样神经元，以及少数或极少数室旁核、