摘 要 应用酶组织化学的方法对非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠胰腺淋巴管的分布及微细结构进行了光镜及电镜观察。5′-核苷酸酶(5′-Nase)阳性小叶间淋巴管具有明显的神经支配和丰富的瓣膜，分布于整个胰腺。小叶内毛细淋巴管虽有典型的结构特征，如不规则的管腔、极薄的管壁和淋巴管内皮细胞的独特连接方式(端端、重叠与指状突起连接)，但数量很少，其分布相对独立于毛细血管(碱性磷酸酶，即

aLPase阳性)。胰岛周围淋巴细胞浸润出现在生后4～5周，并开始于近血管或淋巴管一侧。糖尿病发病后，血糖浓度在短期内急剧上升，胰岛由严重的淋巴细胞浸润转化为β细胞脱颗粒及坏死。淋巴管内一般充满大量淋巴细胞。淋巴管内皮细胞内小泡明显增多，并有广泛的细胞质突起。其开放性细胞间连接均匀地附着有5-Nase反应颗粒，形成了相当大的细胞间通路(500～1500nm)，可见细胞或纤维碎片从组织间隙经此进入淋巴管腔。结果提示，糖尿病胰腺的淋巴管对浸润的淋巴细胞、坏死的细胞成分和某些溶质等的转运具有重要的作用。

非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic, NOD)小鼠，是1974年Tochino^[1]在日本发现的一种自身免疫性糖尿病病理模型。1980年Makino^[2]进一步从商业性Jcl-ICR杂交克隆分离、纯化，以至发展成为一种胰岛素依赖型糖尿病纯系动物株。有关这种小鼠胰岛的进行性、选择性淋巴细胞浸润和β细胞坏死的研究已有较详细的报道。近期的实验研究表明：某些器官出现血管构筑异常，如毛细血管内皮细胞的非细胞性改变及基膜增厚^[3～4]。但有关糖尿病胰腺淋巴管的形态观察及其在病理过程中所起的作用报道极少。

本实验旨在用酶组织化学方法，(1) 描述糖尿病小鼠胰腺的小叶间与小叶内淋巴管的分布及微细结构的改变；(2) 研究淋巴形成的部位和淋巴管内皮细胞对浸润的淋巴细胞及某些溶质的转运途径；(3) 探讨淋巴管病理改变、淋巴细胞浸润(自身免疫性胰岛炎)及高血糖之间的可能内在联系。

材料和方法

NOD雄、雌性小鼠各25只，体重25～37g。乙醚麻醉，经主动脉逆行插管，低温氯化钙甲醛(含4%甲醛，1%氯化钙)固定液灌注。于生后0～35d、35～90d、90～210d和

210～400d 4个阶段分别取材观察。除采用自身对照外，还设定BALB/c正常对照组小鼠

10只。血糖高于2.5g/L,并持续出现尿糖，则定为糖尿病发病。

切取的组织块一部分进一步浸润固定后，乙二醇甲基丙烯酸树脂(JB₂,Polysciences,

inc,Pa,USA)低温包埋，或OCT化合物(OCT compound，Miles,USA)-80℃冷冻包埋。OCT切片采用-18℃恒冷切片机。电镜组织块取自胰头、体、尾。

1.一般组织学分析

HE染色用于检查淋巴细胞的浸润程度，组织学判定标准为：0：胰岛组织未见淋巴细胞；1：浸润的淋巴细胞可见于胰腺导管和血管周围或仅占胰岛总面积的25%以下；

2：浸润面积为25%～50%；3：严重程度的胰岛炎(浸润面积达50%以上)，并可见明显的β细胞坏死像。每一动物标本观察50个胰岛，最后进行综合评价。

2.酶组织化学染色

2.1 光镜观察：5′-Nase染色液含0.2mol/L Tris-maleat缓冲液(pH7.2);2.9mmol/L腺苷-5′-单磷酸(AMP，钠盐为二酶作用物，Sigma, USA); 3.6mmol/L硫酸镁(酶激活剂)；

3.6mmol/L硝酸铅(捕捉剂)和7%葡萄糖^[5]。另添加2mmol/L非特异性ALPase抑制剂-左旋咪唑^[6]。反应条件为37℃，30～90min。二甲胂酸盐缓冲液(含7%葡萄糖)冲洗后，用1%硫化铵室温下进行1～3min的呈色反应。5′-Nase处理后的部分切片可继续进行ALPase染色反应(4℃,30～60min)，其染色液配制方法为：先将40mg萘酚-AS-Mx-磷酸盐(钠盐，

sigma)溶于2ml n,N-Dimethylformamide，再将40mg fast blue BB salt (Sigma)溶于40ml

0.1mol/L Tris-HCl (pH8.5)缓冲液，混合过滤后使用^[7]。

2.2 扫描及反射电镜：光镜检查后的冷冻切片或组织块孵育于上述5′-Nase反应液中，乙醇脱水，丁醇冷冻干燥处理，炭喷涂标本(20～30nm)以防止电荷造成的假象。

日立S-800扫描电镜装有GW30反射电子探头，观察电压20kV，焦点距离10mm^[8]。

2.3 透射电镜：采用两种5′-Nase染色液，一是腺苷酸-铅反应液(pH7.2)，含

0.2mol/L tris-maleate缓冲液20ml；腺苷-5-单磷酸25mg；0.1mol/L硫酸镁5ml葡萄糖3～

4g；蒸馏水22ml和硝酸铅1.5ml^[9]。另一种为腺苷酸-铈反应液，含0.2mol/L Tris-maleate缓冲液(pH7.4) 20ml；腺苷-5′-单磷酸16mg；20mmol/L氯化镁(酶激活剂)4ml；葡萄糖

2g；蒸馏水12ml和20mmol/L氯化铈4ml。于各染色液中添加左旋咪唑以获得特异性反应^[10]。ALPase反应液含0.2mol/L tris-HCl缓冲液(pH8.5)7ml；0.015mol/L硫酸镁13ml;

3% β-磷酸甘油(酶作用物)10ml，葡萄糖3～4g和枸橼酸铅(捕捉剂)20ml^[11]。反应条件均为37℃，25～30min。5′-Nase-ALPse双重染色法不适应于电镜组织块。对照组采用：(1) 省去酶作用物；(2) 将特异抑制剂50mmol/L氯化镍或5mmol/L左旋咪唑添加于标准反应液中；(3) 反应前将酶于37℃，60min条件下灭活。厚100～120μm组织切片经酶组化染色后，2%四氧化锇4℃，2h后固定，乙醇逐级脱水，环氧聚合树脂包埋。1μm半薄切片经0.1%甲苯胺蓝染色以初步鉴定内、外分泌组织的淋巴管或血管的一般外形与分布。超薄切片经乙酸双氧铀染色或无需进一步染色，在JEOL-100CX或1200EX电镜观察。

结果

1. 胰岛炎

本实验所观察的NOD小鼠株，60%雌性和20%雄性于生后270d出现了显性糖尿病。

发病后20只NOD小鼠血糖平均值5.4585g/L(2.98～7.48g/L)，明显高于发病前平均值

1.2656g/L(0.95～1.6g/L)和BALB/c正常小鼠的平均值1.2363g/L(1.17～1.34g/L)(P＜0.001)。

淋巴细胞浸润胰岛(胰岛炎)最早发生于生后30～35d，到生后210d高达84%以上。动物早期阶段(生后90d内)，血糖一般在正常水平，未见胰岛细胞脱颗粒(图1a)。有时可见轻微胰岛炎，胰岛的淋巴细胞浸润始于靠血管或淋巴管一侧，淋巴细胞围绕胰岛、导管和毛细血管。随着血糖浓度的增加，浸润扩散至胰岛外周部，β细胞出现某种程度的脱颗粒。发病后，典型的胰腺表现为进行性胰岛炎，β细胞质内线粒体等膜性结构的膨胀及轻度细胞核固缩(图1b)。严重程度的胰岛炎可见β细胞坏死像。发病末期胰岛以大量β细胞成分的绝对丧失和胰岛的退行性变为特征，浸润的淋巴细胞数量已明显减少。如未经任何处理，小鼠多在发病后3～6周死亡。30只210d未发病的小鼠中22只出现不同程度的胰岛炎。胰岛β细胞外的其他内分泌细胞及胰外分泌部细胞未见结构改变。

2.小叶间淋巴管

5′-Nase阳性小叶间淋巴管局限于腺小叶之间，与小叶间微动脉、微静脉及胰腺导管等伴行(图1c,d;2a,b)。生后90d即可见突向管腔或基底面的淋巴管内皮皱褶。5′-

nase反应颗粒主要分布于内皮细胞的管腔与基底面及某些细胞器的膜表面(图2a,b)。聚集于淋巴管腔内的淋巴细胞通常具有较强的5′-Nase反应活性(图2b)。淋巴管壁附近可见无髓神经纤维分布，但未见直接与淋巴管壁接触。小叶间淋巴管具有典型的两叶瓣膜，阳性反应颗粒也均匀地附着于瓣膜的表面。随着显性糖尿病的发生，淋巴管壁有时可见淋巴细胞穿过。糖尿病持续2～3周的动物，淋巴管内皮细胞明显地向管腔内突起，突起的尖端偶尔延伸至管壁的对侧，但其接触面上仍可见明显的反应颗粒附着(图

2a)。小叶间淋巴管的基膜未发现明显改变。

3.小叶内淋巴管

5′-Nase阳性小叶内淋巴管光镜下染成棕褐色，位于胰腺小叶内并靠近腺细胞；

aLPase阳性小叶内毛细血管染成蓝色，很少与毛细淋巴管伴行。动物早期阶段(生后

90d内)，未见明显结构改变，淋巴管壁极薄而不规则，内皮细胞间以端端、重叠和指状突起连接为特征。结缔组织中可见到围绕淋巴管较少的弹性纤维和胶原纤维，但无明显基膜。胰岛炎出现后，淋巴管内皮细胞和突起明显增加。糖尿病期小鼠的显著特征是在小叶内淋巴管出现宽大的开放性(500～1500nm)细胞间连接，大量的细胞及纤维碎片通过该途径从组织间隙进入淋巴管(图2c,d)。有时可见胰腺小叶内新生的毛细淋巴管，这些淋巴管的5′-Nase活性低，反应颗粒大多散在于内皮细胞中。细胞质富含游离核糖体和粗面内质网，但小泡极少。新生淋巴管周围常可见成纤维细胞。

4.毛细血管

35d前无胰岛炎状态的胰腺毛细血管壁均较平滑、整齐(图2e)。35～90d胰岛炎出现后多表现为细胞突起和内皮小泡的增加(图2f)。糖尿病发病后，血管