摘 要 为了从神经营养因子角度探讨移植修复机理，将大鼠14d胚胎脊髓(ESC)植入急性损伤成鼠脊髓后1、3、5、7、10、15和30d，用原位杂交和斑点杂交技术对ESC和宿主脊髓(HSC)内NT-3 mRNA的变化进行定性和定量观察。定性观察显示，在正常脊髓内，NT-3 mRNA以前角运动神经元和少量胶质细胞分布为主；脊髓损伤以后，杂交产物扩大到中小型神经元，同时更多的胶质细胞参与了反应；ESC植入后，除移植物本身继续表达外，宿主脊髓阳性反应神经元和胶质细胞数量进一步增加。定量结果表明，损伤组原位杂交和斑点杂交的反应强度明显高于正常组；而移植组的分子杂交反应又在很多时相点上显著高于损伤组。除此而外，分子杂交反应在损伤组和移植组内持续的时间也不相同，前者的最强反应期为术后7d，后者为术后10~15d.我们认为，移植的ESC除为自身和HSC提供神经营养外，也诱发了HSC在发生过程中曾经拥有的合成机制，以增强NF表达的方式为自身再生提供营养，同时也为移植物的发育分化提供合适的营养环境。

关键词 脊髓损伤 脊髓移植 神经营养素-3 分子杂交

胚胎脊髓(embryonic spinal cord,ESC)移植不但可以修复成体损伤脊髓(injured spinal

cord,ISC)的组织缺损^[1,2]，对恢复ISC功能也有促进作用^[3]，并能挽救(rescue)损伤的宿主神经元^[4]。根据神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)不仅对感觉神经元、胆碱能神经元和多巴胺能神经元发育分化具有维持和促进作用^［5,6］，还能挽救脊髓损伤神经元而免遭变性死亡^［7］和促使神经肌肉突触在结构和功能上尽快成熟^［8］，我们推测ESC移植后的生长、分化以及修复ISC组织缺损和救援损伤神经元等作用可能和NT-3有关。

为此，本研究将ESC植入成鼠ISC后，对NT-3 mRNA的变化进行原位和斑点分子杂交观察，以从神经营养因子(neurotrophic factor,NF)角度探讨移植修复机理。

材料和方法

1.动物处理与取材

按我们以前^［2］介绍的方法进行脊髓损伤和脊髓移植。主要方法和步骤：以体重

200g左右的Wistar大鼠脊髓为宿主，以同种妊娠14d(E14)的胎鼠脊髓为受体。移植时先半切宿主脊髓腰膨大(L1)左侧并吸出局部脊髓组织，然后由孕鼠子宫内取出E14胎鼠，于显微镜下仔细剥离颈胸段脊髓，用玻璃针头吸取一段长约3mm的纯净胎鼠脊髓，注入脊髓损伤处。确认植入后，用8-0的无创缝合线间断缝合硬脊膜。术后1、3、5、7、

10、15、30d时，随机取6只宿主鼠做原位分子杂交，另取5只用于斑点杂交。做原位分子杂交者麻醉后开胸暴露心脏，经左心室|主动脉系统依次灌注无RNase的PBS 150ml和4%多聚甲醛200ml。灌注固定后2h取出移植部位脊髓，投入相同固定液继续固定2h，然后转入20%蔗糖(无RNase)中过夜；欲做斑点杂交的动物麻醉后直接取出移植部位脊髓，迅速投入液氮中保存备用。

除宿主鼠外，在以上各时相点还另用10只单纯脊髓损伤的大鼠做损伤对照。正常对照动物总共11只，其中原位杂交用6只，斑点杂交用5只。本实验共用受体鼠77只，单纯脊髓损伤鼠70只，包括11只正常对照大鼠在内，各种大鼠共计158只。

2.原位分子杂交

人NT-3 cDNA探针(穆援越博士赠送，北京军事医学科学院)片断长0.44kb，连接于

pUC18质粒多克隆位点EcoRⅠ和HindⅢ之间。质粒的扩增、纯化、酶切和基因片段的回收主要参照文献［９］进行。基因探针标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒(德国Boehringer mannheim Biochemica)说明书操作。原位分子杂交的主要步骤^［10］为：取出蔗糖中过夜标本置冰冻切片机切50μm切片，收集切片于前述固定液中固定10min，依次经浸洗、蛋白酶K(2mg/L)消化、4%多聚甲醛再固定、0.25%乙酸酐封闭等10余步处理后，入杂交液(探针浓度500μg/L)于42℃恒温水浴中杂交25h，其后分别经浓度递减的系列标准枸橼酸盐溶液(SSC)漂洗，再入地高辛抗体工作液(1∶1 000)室温中作用

12h，此步完成后分别经0.05mol/L pH7.2 PBS、缓冲液1、缓冲液3漂洗，入新鲜配置的显色液于室温下黑暗中显色12h，转切片入缓冲液4，并在此液中将切片平铺于涂有粘附剂的载玻片上，风干切片，1%甲基绿复染15min，然后经系列乙醇脱水、二甲苯透明，最后用封固剂DPX封片。

原位分子杂交切片对照采用：(1)杂交前用RNA酶100mg/L于37℃预处理切片30min；(2)杂交液内去除标记探针；(3)杂交液内加入未标记探针。

3.斑点杂交

将用异硫氰酸瓜-酚-氯仿抽提法^［11］提取的脊髓RNA水溶液(浓度约为1.4g/L)与等体积甲醛变性溶液混匀，然后于60℃水浴中变性30min，取出之置室温中冷却，再将其点到经过预处理的硝酸纤维素膜上，另取标准品(1∶10倍比稀释)同时点膜以做对照。待膜自然晾干后，将其置于两层滤纸中间转入80℃真空烘烤2h。转移杂交膜于塑料袋中，按0.2ml/cm²杂交膜面积的比例向袋中加入预杂交液，封口后于42℃预杂交1h。剪开塑料袋，吸除预杂交液，再按1ml/cm²膜面积加入新配杂交液(标记探针

400μg/L)，封膜后42℃杂交24h。取出杂交膜，用2×SSC-0.1%SDS室温下洗涤数次，

0.1×SSC-0.1%SDS55℃洗膜2×30min，缓冲液1和缓冲液2各洗2×5min。将杂交膜转入新配显色液，室温避光过夜显色。

4.结果观察和定量

首先将原位杂交切片做光镜定性观察。然后随即选取3只动物的切片标本，在10×20倍下每标本随机摄取5个视野，如此每组得到105幅光镜组织学图像(正常对照组

15幅)。在计算机图像分析系统下计数每张图像上的阳性反应细胞数，最后推算出每

100μm²中的面数密度；测量细胞反应强度时，用相同图像分析系统随机在每张图像上测量10个细胞的反应灰度值，以其平均值表示该动物标本中的反应强度。

斑点杂交结果用真彩色扫描仪扫描入计算机系统，在Photo>线。NT-3在各时相点的反应灰度值也用相同办法测出，再依据它们的反应强度与浓度变化曲线求出每微克总RNA中mRNA的拷贝数。

5.统计学分析

所有数据均进行t检验分析。

结 果

1.移植物存活情况

将ESC植入ISC后，ESC不仅存活，也呈现了逐渐生长发育过程。术后早期，移植物的体积小，其内神经元的数目多，但体积小，染色深，形态上类似神经母细胞和神经上皮细胞(图1)。后期，移植物的体积虽然增大，神经元的形态也显正常，但神经元的数目却减少(图2)。

2.原位分子杂交

2.1 定性观察：在正常动物的脊髓内，深蓝色细颗粒状杂交产物主要存在于前角运动神经元胞浆(图3)，少数胶质细胞中也可观察到反应颗粒，但由于反应产物的遮蔽，光镜下很难对这些阳性胶质细胞做进一步分类。脊髓损伤后1d，每张切片平均约8个左右前角运动神经元呈现颗粒稀疏的阳性反应，但阳性杂交的胶质细胞比较少见。此后，除前角运动神经元外，部分中、小神经元也慢慢呈现阳性反应，同时阳性胶质细胞的数目增多，胞浆内杂交颗粒也逐渐密集，至术后7d各种阳性细胞的数目最多，反应颗粒也最为密集(图4)。7d后，上述反应逐渐减弱，到术后15d时，单纯ISC内的反应情况基本减弱到正常脊髓的水平。将ESC植入ISC后1d，很多前角运动神经元及不少中、小型神经元和胶质细胞就呈阳性反应。术后7d这种反应势头有增无减，到术后15d时，很多上述细胞仍然呈现较强的反应(图5)。

E14 ESC在移植前呈很强的NT-3 mRNA杂交反应(图6)。将其植入到损伤脊髓后

1~7d，由于娇嫩的ESC尚未和宿主脊髓(host spinal cord,HSC)形成完善的组织连接，因此它们大多被杂交过程中必不可少的蛋白酶K处理消化殆尽。但从残存的组织碎片上，仍然可见移植物呈强阳性反应。术后15d时，移植物已和HSC形成了疏松的组织连接，由此可见，幼稚的胚胎神经元和胶质细胞内有较强的杂交信号(图7)。

2.2 定量观察：NT-3 mRNA原位杂交阳性神经元数目和反应灰度值分别列于表1和表2。可以归纳出，损伤组内阳性神经元的数目和反应灰度值在术后有一个逐渐增高和回落的过程，峰值在术后7d时出现。除术后1d和30d外，两种数值与正常组的相比均有显著差异。

移植组的阳性反应神经元数目和灰度值在术后同样有一个逐步增高的过程，但增加幅度大，持续时间长，数目和灰度的最大值均表现在术后15d。由于术后7d以后损伤组的相应数值逐步下降，移植组的对应值则在术后10d至30d的各时相点上与损伤组的相比有显著(P＜0.05)或非常显著(P＜0.01)的差异。

3.斑点杂交

NT-3 mRNA斑点杂交反应图谱呈现在图8。表3是根据图谱所计算的每微克总