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葛煦饶志仁杨志军
摘要目的：观察儿茶酚胺类（以酪氨酸羟化酶为标记物）、5-羟色胺以及神经肽（P物质、神经肽Y、甲硫氨酸脑啡肽）等物质在猫延髓内脏带细胞、纤维和终末中的分布.方法：免疫组织化学ABC法.结果:上述物质均较集中地分布于延髓中尾段一条从背内侧至腹外侧的弧形带状区内.结论：延髓内脏带是一相对独立的机能结构区.
关键词： 酪氨酸羟化酶5-羟色胺神经肽类延髓内脏带猫
0引言
既往研究［1,2］证实在大鼠延髓中尾段的横切面上，存在一条从背内侧至腹外侧的弧形带状区，称为延髓内脏带（MVZ）. 其主要结构包括孤束核（NTS）、最后区（AP）、迷走神经背核（dmnX）、中间网状带（IRt）、疑核（nA）以及延髓腹外侧部（VLM）等，不同刺激条件下的实验［3～6］表明，MVZ和内脏活动的调节关系密切. 免疫组织化学研究证实，许多种神经活性物质及其受体在大鼠［1，7］、猴［8，9］及人胎儿［9］的MVZ中有密集分布. 而关于猫延髓的化学构筑尚未见到报道. 我们采用免疫组织化学ABC方法，对儿茶酚胺（以酪氨酸羟化酶-TH为标记物）、5-羟色胺（5-HT）以及P物质（SP）、神经肽Y（NPY）和甲硫氨酸脑啡肽（M-ENK）在猫延髓内的分布及形态学特点进行了探讨.
1 材料和方法
1.1动物成年猫5只，由本校实验动物中心提供，雌雄不拘，体质量1.6 kg～2.5 kg, 分为2组进行实验. A组（n=3）直接灌注取材，用于观察TH、5-HT阳性结构的分布；B组（n=2）动物于10 g/L 戊巴比妥钠麻醉下，侧脑室内注入秋水仙素（1 mg/kg），存活48 h后取材，用于观察神经肽类胞体、阳性纤维和终末的分布.
1.2组织固定和切片制备以上所有动物在10 g/L戊巴比妥钠深度麻醉下（40 mg/kg，ip.）开胸，经左心室插管至主动脉，先以9 g/L的NaCl 500 mL快速灌流冲洗血液，继之用含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液（PB, pH 7.4）1 000 mL先快后慢灌流固定，注毕立即取出延髓，浸入300 g/L蔗糖溶液至组织块沉底（4℃）. 用冰冻切片机切制连续切片，切片方向与延髓纵轴垂直，片厚30 μm. 切片收集于0.01 mol/L PBS中，并按顺序分为数套，每套切片进行下述一种物质的免疫组织化学反应.
1.3免疫组织化学反应按ABC法进行. 切片入含3 mL/L TritonX-100的PBS（0.01 mol/L）中室温浸泡30 min，用0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次，分别浸入小鼠抗TH单克隆抗体（1∶5 000）血清、兔抗5-HT（1∶3 000），SP（1∶5 000），NPY（1∶5 000）以及M-ENK（1∶3 000）多克隆抗体血清(均为Incstar公司产品)，4℃孵育48h后用0.01 mol/L PBS洗10 min×3次，再分别入生物素化的驴抗小鼠或羊抗兔IgG（Sigma，B6398或B6648，1∶500），室温放置3 h，0.01 mol/L PBS洗10 min×3次，然后移至Avidin-Biotin HRP Complex-ABC液（Sigma，E8386，1∶500）中，室温放置2 h，0.01 mol/L PBS漂洗后，用硫酸镍胺-葡萄糖氧化酶方法进行呈色，常规贴片、干燥、脱水透明、DPX封片，光镜观察. 另取一组切片进行对照实验，用0.01 mol/L PBS代替一抗浸泡切片48 h（4℃），以后步骤同前.
1.4阳性结构的半定量观察按以下标准：细胞密度根据切片上单位视野（约200 μm×200 μm）内阳性胞体个数， 分为3+: 10个以上， 2+:6个～10个， 1+:1个～5个， -:0个4级. 阳性纤维和终末的密度分为非常密集（++++）、密集（+++）、中度（++）、稀疏（+）和未见到阳性纤维和终末（-)5级.
延髓核团的划分及名称，参照Verhaart［10］和Taber［11］的研究.
2结果
镜下观察可见，TH,5-HT,SP,NPY和ENK等免疫反应阳性结构在猫MVZ内均有较高密度的分布，与周围结构区别明显（Fig 1），呈现为一条由背内侧至腹外侧部的弧形带状区. 该带尾吻长约7.0 mm(从锥体交叉平面—闩以上2.9 mm),在横切面带的宽度为0.4 mm～2.5 mm. 从尾侧至吻侧可分为4个平面，即锥体交叉平面、闩平面、最后区平面和吻侧平面. 为描述方便，我们将MVZ分为背内侧部（DM，包括NTS,AP,dmnX等）、腹外侧部（VLM，包括nA、外侧网状核-LRt、腹外侧网状核-VLRt等）和中间部（IRt，指位于二者之间的弧形网状带）. 各种递质在最后区平面的分布详见Fig 1.
图 1猫延髓最后区平面TH，5-HT，SP，NPY及ENK免疫反应阳性胞体(●)、纤维（≡）和终末（∴）的分布
fig 1Schematic illustration of the distribution of TH,5-HT,SP,NPY and M-ENK immunoreactive positive structures in the area postrema level of the medulla oblongata of the cat. The neuronal bodies(●),fibers(≡),terminals(∴) were visualized.
AP：Area postrema; NTS:Nucleus of solitary tract; TS:Solitary tract; dmnX:Dorsal motor nucleus of the vagus nerve; Ⅻ:Hypoglossal nucleus; Cu:Cuneate nucleus; ECu:External cuneate nucleus; IV:Inferior vestibular nucleus; nSpV:Spinal trigeminal nucleus; LRt:Lateral reticular nucleus; VLRt:Ventrolateral reticular nucleus; nA: Nucleus ambiguus; IO:Inferior olive nucleus; RO:Raphe obscurus nucleus; RP: Raphe pallidus nucleus.
2.1胺类递质
2.1.1TH和5-HT阳性胞体TH阳性胞体见于MVZ全长，多数位于DM和VLM的VLRt，少数散在于IRt. 细胞形态在DM以小型梭形或卵圆形细胞为主（Fig 2），在IRt区以小型梭形细胞为主，胞体长轴沿背内—腹外方向伸展，而在VLM则为中等大小的多角形细胞. 延髓其它部位未见TH阳性胞体分布. MVZ内5-HT阳性胞体偶见于腹外侧区和中间带，多为中小型梭状细胞（Fig 3），dmnX,AP,NTS内无胞体. 而延髓中缝核群中可见大量阳性胞体.
图 2NTS中的TH阳性神经元和纤维
fig 2The TH positive cell bodies and fibers in NTS×200
图 3IRt中的5-HT阳性神经元
fig 3The 5-HT positive neurons in IRt×200
2.1.2TH和5-HT阳性纤维和终末阳性纤维主要呈两种形态，即串珠状细纤维（带膨体）和光滑的粗纤维. 终末呈点线状或颗粒状. TH阳性纤维主要为光滑的粗纤维，见于整个MVZ，以DM中的NTS为明显，并于孤束核连合亚核处以平行纤维左右相接（Fig 2）. IRt处纤维多沿背内—腹外方向伸展，彼此接近平行. 背内部可见一束巨大的纵行纤维束，贯穿延髓全长，与外侧横行纤维分界明显（Fig 4）. 5-HT纤维多呈串珠状（Fig 5），交织成网，以DM的dmnX分布最为密集. 此外，还可见到5-HT阳性纤维垂直穿过血管壁、室管膜，与管腔内容物发生联系（Fig 6）. 纤维和终末的数量从延髓的尾侧向吻侧逐渐减少.
图 4IRt中的TH阳性纤维和终末
fig 4The TH positive fibers and lerminals in IRt×800
图 5DM中的5-HT阳性纤维和终末纤维呈典型串珠状
fig 5The 5-HT positive beads-haped fibers and terminals in DM×800
图65-HT阳性纤维垂直穿过室管膜
fig 6The 5-HT positive fibers crossing the ependyma vertically×400
2.2神经肽类
2.2.1SP,NPY,ENK阳性胞体SP阳性胞体的数量最多，遍及MVZ各部，以dmnX处最为密集，细胞多呈卵圆形或梭形. 网状结构中的细胞形态以IRt为界分为3组：带内侧为小的卵圆形或多角形细胞，带上为中等大小的梭形细胞（Fig 7），而带的外侧为大的多极神经元，界限清晰（Fig 8）. NTS中的阳性胞体有明显的亚核定位，连合亚核（nCOM）、胶状质亚核（Sg）、腹侧亚核（vnTS）较为密集，而内侧亚核（mnTS）等分布较少. NPY胞体见于AP,NTS,VLM，胞体为梭形或多边形. 在NTS中以mnTS,Sg,nCOM 3个亚核中更为密集（Fig 9）. 此外，还可在延髓中缝核群观察到大量5-HT的阳性胞体. ENK在AP,VLRt中可见少量胞体，形状不规则.
