摘要目的探讨线粒体DNA（mtDNA）片段的恶性转化效应和转化机制。方法采用基因转入技术，观察经mtDNA片段转染后小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）在裸小鼠体内的成瘤能力，并对形成的肿瘤进行病理观察；同时应用荧光原位杂交（FISH）方法，观察mtDNA片段在NIH3T3细胞核内的整合情况。结果转染后1周,18%～20%的NIH3T3细胞核中发现有目的基因探针的阳性杂交信号；转染后2周的培养细胞在裸小鼠皮下形成肿瘤的能力为100％（8/8）；且形成肿瘤的病理表现与纤维肉瘤的特征相一致。结论mtDNA片段在核基因组中的自发整合是促发细胞癌变的又一因素。

Malignant transformation of mouse embryonic fibroblast induced by mitochondrial DNA fragments

HU YideQIAN GuishengMAO baolingXIAO TaoyuanLI YiCAO shilong（PLA Institute of Respiratory Diseases, Xinqiao hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China）

AbstractObjectiveTo investigate the malignant transforming effect and mechanism of mitochondrial DNA(mtDNA) fragments.MethodsTumorigenicity of mtDNA-transformed mouse embryonic fibroblast (NIH3T3) in nude mice was studied using transgenic techniques. Transformed tumors were detected by pathological examination and hybridization signals of mtDNA probe were analyzed by fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques.ResultsHybridization signals were observed on the nuclei of 18%～20% NIH 3T3 cells 1 week after mtDNA fragments transforming. Tumor from mtDNA-transformed nIH 3T3 cells was developed in all 8 nude mice (8/8) respectively 2 weeks after the transformation. The pathological characteristics of the tumors developed were similar to that of fibrosarcoma.ConclusionsAuto-integration of mtDNA fragments into nuclear genome is a new factor involved in carcinogenesis.

KeywordsDNA, mitochondrial;Fibroblasts;Mice,nude;Animal testing alternatives

目前，关于肿瘤病毒或活化癌基因能诱导良性细胞恶性转化的研究已非常普遍。但作为哺乳动物细胞唯一核外基因组的线粒体DNA（mitochondrial dNA, mtDNA），是否也具有类似于肿瘤病毒那样的活性尚缺乏有力的实验证据^［1，2］。前期研究发现，癌细胞核基因组中存在mtDNA的同源序列。这些同源序列的来源及其在细胞癌变中的作用也仅仅是理论上的推测。我们通过mtDNA片段向小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）进行基因转入的方法，探讨了mtDNA片段的恶性转化效应及转化机制。

材料与方法

1.主要试剂：PCR试剂盒,PCR产物纯化试剂盒,PCR地高辛（DIG）探针合成试剂盒，抗DIG荧光抗体均为德国宝灵曼公司产品。

2.实验动物： 选大小相近的BALB/C裸小鼠16只,体重13 g±5 g，用于转化细胞体内接种实验。

3.受体细胞及细胞培养：选用NIH3T3（美国，NIH）为受体细胞。将3×10⁵细胞接种于100 ml细胞培养方瓶中,加入含15%小牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃5% CO₂孵箱中无菌培养，每3天传代1次。

4.目的mtDNA基因片段的PCR扩增与纯化： 引物1：5′-ATCTTAATGGCACATGCAGC-3′,引物2：3′-TCTAATGTGTACGTTCGTTCGTAG-5′,扩增包含CoⅡ、tRNA^Lys、ATPase 6共3个完整基因在内的1626 bp mtDNA片段。用此片段作为转染目的基因片段。以人肺腺癌SPC-A-1细胞（取自中科院上海细胞所）mtDNA为模板，扩增的mtDNA基因片段，代表癌细胞来源的mtDNA片段；以1名无肿瘤及也无其他遗传病家族史的45岁健康男性外周血白细胞mtDNA为模板，扩增的mtDNA片段，代表正常细胞来源的mtDNA片段。mtDNA模板的制备及PCR扩增方法参见文献［3，4］。 pCR产物的纯化参照试剂盒说明书进行。

5.实验分组：Ⅰ组：NIH3T3细胞不经任何因素处理空白对照；Ⅱ组: nIH3T3细胞不加mtDNA片段转染假转染对照； Ⅲ组:NIH3T3细胞加癌细胞来源的mtDNA片段转染；Ⅳ组: NIH3T3细胞加白细胞来源的mtDNA片段转染。

6.基因转染:将0.8 ml细胞悬液（4×10⁶/ml）转移至无菌转染杯中，加入10μg mtDNA片段（30 μl TE液溶解，Ⅱ组只加30 μl空白TE液）,混匀，室温静置10 min；将转染杯置于基因脉冲仪（Bio-Rad）的放电槽中，800 V电击0.4 ms，室温静置10 min，分装重新培养，倒置显微镜下对比观察各组细胞的增殖活力和饱和密度变化。

7.染色体制备及G显带：取Ⅰ组和转染后培养1周的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组细胞，参照吴秉铨介绍的方法^［5］进行。结果判断：以20对染色体核型为二倍体，多于或少于20对者为异倍体。

8.荧光原位杂交（FISH）：采用步骤4的白细胞mtDNA为模板，引物1和引物2配对，DIG标记PCR扩增合成1626 bp mtDNA探针并纯化；参照路建平介绍的方法^［6］进行FISH分析。

9.转化细胞裸小鼠体内接种及病理观察：Ⅰ组和转染后培养2周的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组细胞各取4×10⁶个,用0.8 ml含15%小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮,等分后接种于裸小鼠右腋部皮下,每组2只。作好标记，饲养2～3个月，观察裸小鼠的存活及肿块生长情况。对形成肿瘤进行大体形态、光镜及电镜观察。首次实验结束后，进行包括转染、接种在内的重复实验。

10.统计学方法:采用卡方检验。

结果

1.mtDNA目的基因片段及DIG标记探针电泳分析：两种细胞来源的mtDNA模板经扩增后,获得了1626 bp的目的基因片段和DIG标记的探针,纯化后引物二聚体及多余的单核苷酸消失（图1）。

2.转染细胞生长特性变化：Ⅰ组和Ⅱ组细胞呈单层生长；而Ⅲ组和Ⅳ组细胞在转染24 h后部分死亡，48 h后残余细胞恢复增殖活力，达到饱和密度时呈重叠生长。

1.SPC-A-1细胞mtDNA为模板扩增的目的基因片段；

2.正常人白细胞mtDNA为模板扩增的目的基因片段；

3.正常人白细胞mtDNA为模板扩增的DIG标记探针；

4.λ DNA/Hind III Marker。

图11 626 bp mtDNA目的基因片段及DIG标记探针电泳图谱

3.转染细胞染色体倍性变化：Ⅰ组和Ⅱ组细胞染色体核型中60%为二倍体，40%为异倍体；而Ⅲ组和Ⅳ组细胞染色体核型中异倍体达90%以上。

4.FISH分析：Ⅰ组和Ⅱ组细胞中期染色体或间期核中均无人mtDNA探针的阳性杂交信号，而Ⅲ组和Ⅳ组部分细胞中期染色体或间期核中出现了阳性杂交信号（图2～5）；Ⅲ组阳性率为20%，Ⅳ组阳性率为18%，两组间差异无显著性。

5.转染细胞在裸小鼠体内的成瘤能力：Ⅰ组和Ⅱ组细胞在裸小鼠皮下形成肿瘤阳性率为0（0/8）；而Ⅲ组和Ⅳ组细胞在裸小鼠皮下形成肿瘤阳性率为100%（8/8）。

6.形成肿瘤的病理变化：Ⅲ组和Ⅳ组细胞的形成肿瘤。大体形态上,表面凹凸不平，呈分叶状，局部有坏死现象，解剖观察可见皮下的分叶结节样肿块（图6,7），包膜不完整，与周围组织有粘连，肿块的切面呈灰白色，质地细腻，似鱼肉样，各脏器未见转移结节灶。光镜下见梭形细胞相互交织，排列紊乱，瘤细胞丰富，大小不一，极性消失，具有显著的异型性，核分裂象多，胶原纤维和血管少见，瘤细胞之间可见少量脂肪细胞。此外，瘤细胞对邻近肌组织有明显的侵袭现象（图8,9）。电镜下见瘤细胞核大，畸形，核膜凹凸不平，核染色质分布不均，核仁大，可见较多的双核仁，细胞粗面内质网发达，并有囊状扩张，线粒体较丰富，但发育不良，少量细胞胞质中可见肌微丝，细胞间隙较明显，其中可见极少量胶原纤维(图10，11)。

图2，3Ⅰ、Ⅱ组细胞中期染色体或间期核中无人mt dNA探针的阳性杂交信号FISH×1 200图4，5Ⅲ、Ⅳ组部分细胞中间染色体或间期核中出现了阳性杂交信号(箭头所示)FISH×1200