摘要目的探讨含单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)基因细胞对丙氧鸟苷(GCV)敏感度不均一的原因以及在GCV作用下细胞被杀伤的途径——坏死或凋亡。方法将表达HSV-TK基因的重组逆转录病毒载体，分别直接导入生长速度不同的3个细胞系,胰腺癌细胞系(PC-2, pC-7)和猪肾小管上皮细胞系（LLC-PK1)，计算转染前后细胞倍增时间，MTT法检测50%细胞生长受抑制时的GCV浓度(IC₅₀值)；流式细胞术检测细胞周期；对GCV作用细胞和(或)移植瘤进行光镜和电镜的形态观察及原位凋亡检测。结果倍增时间分别为(31.2±0.1)、(48.3±0.1)、(53.9±0.1)h的细胞，其转染细胞IC₅₀值分别为(0.73±0.12)、(0.93±0.16)、(1.22±0.06)μmol/L，呈正相关；细胞被阻滞在S期；经GCV作用的细胞肿胀崩解坏死，个别细胞表现凋亡；经GCV作用的移植瘤显示大片坏死。结论HSV-TK/GCV系统对增殖旺盛的细胞作用更为显著，GCV作用的3个转染细胞系细胞的死亡途径主要为坏死。

Different susceptibility of cell lines to thymidine kinase/ganciclovir-mediated killing effect and the way of cell death

ZHANG LeiLIU TonghuaCUI quancaiGAO Jie（Department of Pathology, Peking Union Medical College hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, beijing 100730, China）

AbstractObjectiveTo investigate the mechanism of variability of herpes simplex virus (HSV) thymidine kinase (TK)/ganciclovir (GCV)-mediated suicide effect obtained in three different cell lines and the ways in which this system-mediated cell killing occurs.MethodsRecombinant retroviral vector expressing HSV-TK was transduced into three cell lines known with different growth rate (PC-2, PC-7 and LLC-PK1). The doubling time of the transduced and parental cells was calculated. MTT method was used to detect the concentration of GCV at which cell growth was inhibited by 50% (IC₅₀ value). Cell cycle was analyzed by flow cytometry. Necrosis or apoptosis of cultured cells and/or xenografts was observed under light and electron microscope, and by in situ apoptosis detection.ResultsThe doubling time of the three parental cell lines was (31.2±0.1) h, (48.3±0.1) h, and (53.9±0.1) h, separately. The IC₅₀ values of their hSV-TK-transduced cell lines to GCV were (0.73±0.12) μmol/L,(0.93±0.16) μmol/L and (1.22±0.06) μmol/L, respectively and the IC₅₀ value was correlated with the cell doubling time. Flow cytometry revealed S arrest. The majority of cells under treatment of gCV displayed swelling and collapse, but very few cells showed apoptosis. Large areas of necrosis were observed in the xenografts.ConclusionsThe cells with high growth rate are more susceptible to HSV-TK/GCV-mediated killing effect. Necrosis is the main way in which cells of the three HSV-TK-transduced cells lines die.

KeywordsPancreatic neoplasms;Thymidine kinase;Guanosine;Gene transfer;Necrosis;Tumor cells, cultured

单纯疱疹病毒(herpes simples virus, HSV)胸腺嘧啶核苷激酶(thymidine kinase, TK)/丙氧鸟苷(ganciclovir, gCV)自杀基因系统已被证实在多种肿瘤的实验性基因治疗中具有显著疗效，并已用于脑肿瘤的临床实验基因治疗^［1］。但在这个系统中还有许多问题尚未解决，如含HSV-TK基因的不同细胞对GCV敏感性不同的原因、受GCV作用的细胞发生凋亡还是坏死、携TK基因肿瘤细胞鼠移植瘤接受GCV治疗后对同源肿瘤细胞产生特异性免疫的机制等^［2，3］。我们将TK基因转入多个细胞系，对这些问题进行初步探讨。

材料和方法

一、材料

人胰腺癌细胞系PC-2和PC-7为我科自建，猪肾小管上皮细胞系LLC-PK1（简称PK1）由协和医院肾内科实验室提供；含HSV-TK基因全长cDNA的重组逆转录病毒载体新霉素阻抗基因胸腺嘧啶核苷激酶(NTK)由美国Bedford memorial Veterans医院Dr. Moolten惠赠；含β-半乳糖苷酶基因的对照重组逆转录病毒载体NCMVβ为我科自备。neo基因扩增引物：N1:5′-AGAGGCTATTCGGCTATGAC-3′和 n2:5′-GATACTTTCTCGGCAGGAG-3′由Cybersyn公司合成，扩增产物为292 bp；GCV由美国加州Syntex公司惠赠；原位凋亡检测试剂盒为Boehringer mannheim公司产品；4周龄雌性Balb/c裸鼠购自中国科学院动物所。

二、方法

1．质粒DNA的转染： PC-2、PC-7及PK1细胞用含10%胎牛血清(Gibco公司)的RPMI1640培养基，在37℃ 5% CO₂条件下培养，当贴壁生长的细胞达50%～60%融合时，用Lipofectin介导的DNA转染方法,将重组逆转录病毒载体新霉素阻抗基因胸腺嘧啶核苷激酶(NTK)及对照NCMVβ分别直接导入3个靶细胞系,经G418(600 μg/ml)筛选2～3周后得到抗药性克隆，随机挑取克隆扩大培养，分别命名为PC-2/NTK、PC-7/NTK和PK1/NTK。

2.聚合酶链反应(PCR)扩增neo基因：按“分子克隆实验指南”方法^［4］提取细胞基因组DNA，50μl反应体系含：0.5 μg模板DNA,上、下游引物各0.5 μg, 1×PCR缓冲液，1.5 mmol/L MgCl₂,2.0 mmol/L dNTP及5 UTaq DNA聚合酶，采用94℃变性1 min，59℃退火1 min；72℃延伸1 min的条件，扩增36个循环，产物行2%琼脂糖凝胶电泳进行分析，以未转染的PC-2细胞作阴性对照，以含neo基因的NTK质粒为阳性对照。

3.Northern blot分析TK基因表达：以NTK载体中的TK cDNA片段为探针，细胞总RNA的提取采用异硫氰酸胍一步法^［5］，RNA的电泳、转膜及cDNA的标记与杂交参阅文献［4］。

4.β-半乳糖苷酶表达检测：参阅文献［6］。

5.计算细胞倍增时间^［7］：细胞以1.5×10⁴/孔接种24孔板,每种细胞3孔, 4 d后用锥虫蓝(又称台盼蓝)染料排除法计数活细胞,倍增时间=时间(h)/细胞分裂次数(n), n=ln(p/x)/ln2(p为n次分裂后的细胞数, x为细胞接种数)。

6.噻唑蓝（MTT）法检测转化细胞对前体药物的敏感度及IC₅₀值：GCV浓度取0、0.1、0.5、1、5、10、100、500、750、1000 μmol/L，按Osaki等^［8］的方法进行检测,细胞存活率=用药组吸光度(A，曾称光密度OD)值/非用药组A值×100%,细胞生长抑制率=(1-用药组A值/非用药组A值)×100%。经Slide软件处理得出药物剂量-反应曲线，求出50%细胞受抑制时的药物浓度，即IC₅₀值。

7.流式细胞术检测细胞周期: 收集约1×10⁶个细胞,70%预冷乙醇固定过夜, RNase消化后碘化丙锭(PI)标记，在Coulter公司EPICS流式细胞仪上进行DNA含量分析,检测细胞碎片或凋亡细胞及细胞周期。

8.药物作用细胞的形态观察与原位凋亡检测：用20 μmol/L gCV对NTK转染细胞作用5 d后，进行形态观察，并按试剂盒介绍的方法进行原位凋亡检测。

9.药物作用裸鼠移植瘤的光镜及电镜观察：6只4周龄雌性Balb/c裸鼠左侧背部皮下接种1×10⁷个PC-2细胞，右侧接种1×10⁷个PC-2/NTK细胞，2周后瘤体可触及时(约0.3 cm～0.4 cm)，其中3只腹腔内注射GCV，150 mg/kg，2次/d，共5 d，另3只作为对照腹腔内注射PBS，停药后6～8周比较瘤体大小^［9］。取GCV作用组PC-2/NTK细胞移植瘤制成标本，在光镜和电镜下观察细胞形态。

10．统计学处理用方差分析。

结果

1．转染细胞株的建立：G418筛选后所得PC-2/NTK、PC-7/NTK和PK1/NTK细胞株PCR检测，可见292 bp的neo基因扩增产物和154 bp的Ki-ras内参照扩增产物, 未转化的PC-2细胞只见Ki-ras扩增产物,表明外源基因已进入转化的PC-2细胞(图1)。Northern blot杂交分析可见各转染细胞中均有1.3 kb TK mRNA杂交带, 证实外源TK基因可以有效表达且表达量基本相同（图2）。对NCMVβ转染各细胞进行β-半乳糖苷酶组织化学检测，可见其转染的PC-2、PC-7及PK1细胞均呈蓝色，表明对照NCMVβ载体已进入细胞并表达。

2.细胞倍增时间：对各转染前后细胞的倍增时间进行检测，发现(表1)各转染细胞与相应的未转染细胞彼此间差异无显著性(方差分析，P＞0.05)，表明外源基因的整合与表达对细胞生长速度无影响；但PC-2、PC-7、PK13种细胞间则差异有显著性(P＜0.05)，增殖速度顺序为PK1＞PC-2＞PC-7。

3．转染细胞对GCV的敏感性及其差异：MTT法检测示(表2)，PC-2/NTK、PC-7/NTK、PK1/NTK的IC₅₀值分别为(0.93±0.16)、(1.22±0.06)、(0.73±0.12)μmol/L，均低于相应未转染细胞和对照质粒转染细胞600～800倍，差异有显著性(方差分析，P＜0.01)，表明含TK基因细胞对GCV的敏感性明显增高。但NTK转染的PC-2、PC-7、PK1细胞之间对GCV的敏感性有所不同，PK1/NTK与PC-2/NTK和PC-7/NTK的IC₅₀