【摘要】目的研究p16基因在乳腺癌中的纯合缺失、高甲基化和突变等结构变化及其与表达之间的关系。方法应用聚合酶链反应（PCR）和PCR甲基化银染分析技术(PCR-MASS)对60例乳腺癌和24例癌旁组织进行了p16基因纯合缺失和p16基因第1外显子的甲基化检测；用PCR-单链构象多态性（SSCP）和DNA测序技术进行了p16 基因突变分析；检测了p16蛋白和mRNA的表达。结果60例乳腺癌中，检出7例(11.7%)纯合性缺失、16例(26.7%)高甲基化、4例(6.7%)点突变。p16蛋白、mRNA的阳性率分别为46.7%(28/60例)、65.0% (39/60例)。结论p16基因在乳腺癌中有多种形式的结构异常。其结构的变化使p16表达障碍，其主要机制是p16基因高甲基化，而p16基因纯合缺失和突变仅为次要原因，p16 基因表达异常参与了乳腺癌的进展及转移。

A study on homozygous deletion, hypermethylation, mutation and expression of p16 gene in human breast cancerGUO Shanchun, LIAO Songlin^*, MENG Zhenhang, LIU Jianying, HUANG Mei, WANG Dan, DING Huaye.^* Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing, 100083

【Abstract】ObjectiveTo investigate the homozygous deletion (HZD), hypermethylation and mutation of p16 gene in human breast cancer and the relationshsip between the structural alterations of p16 gene and its expression.MethodsPCR and PCR-methylation assay with silver staining (PCR-MASS) were used to detect HZD and hypermethylation of p16 gene exon 1 in 60 fresh breast cancers and 24 normal breast tissues adjacent to cancer (as control tissues). PCR-SSCP and DNA sequencing were used for the analysis of p16 gene mutation. Moreover, p16 gene and mRNA were also detected in the 60 cases.ResultsOf the 60 breast cancers, HZD was found in 7 cases, hypermethylation and mutation were found in 16 and 4 cases respectively, and the difference was statistically significant. The positive rates of p16 protein and mRNA in breast cancer were 28/60 and 39/60 respectively.ConclusionThe results demonstrate that several kinds of p16 gene structural changes exist in breast cancer. The structural changes of p16 gene cause abnormal p16 expression, the main mechanisms are hypermethylation, while HZD or mutation are the secondary causes. Abnormal expression of p16 gene then becomes involved in the development and metastasis of breast cancer.

【Key words】Breast neoplasmsDNA mutational analysisMethylationGene deletionGene p16

p16基因是近年新发现的一种抑癌基因，位于人类第9号染色体短臂21区(p21)，编码相对分子质量为16 000的蛋白质，可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4和6的活性，防止细胞增殖。研究表明，在多种细胞系和实体肿瘤中存在着p16基因的缺失、突变或高甲基化等改变，提示p16基因可能与多种肿瘤的发生、发展有关^［1］。一些学者认为，p16基因在肿瘤发生中的意义可与p53基因相当。有关p16基因在乳腺癌中变化的研究国内外陆续有些报道，p16基因纯合缺失在乳腺癌细胞系可高达60%，在实体标本中无论纯合缺失率，还是突变率均较低。为探讨p16基因在乳腺癌发生发展过程中的变化规律和意义，明确乳腺癌的发生发展机制及为预后判断提供检测指标，我们对p16基因、蛋白及mRNA在乳腺癌组织中的纯合缺失、高甲基化、突变及其表达进行了研究。

材料与方法

1．病例的收集和处理：收集北京医科大学附属第三医院、北京军区总医院和北京济慈乳腺医院乳腺癌新鲜标本60例。从每例标本中取1～3块癌组织及癌旁组织，于液氮中速冻，然后再放入-70 ℃冰箱中保存备用。剩余癌组织及淋巴结，4%甲醛固定，常规石蜡包埋，制片，HE染色，光镜观察进行分级。

2.p16基因的聚合酶链反应（PCR）扩增及纯合性缺失检测： 用蛋白酶K消化- 氯仿抽提法提取DNA。p16基因第1外显子(exon 1)引物一对，由本病理系合成，p16基因第2外显子(exon 2)引物两对，PCR扩增标准内参照β-actin引物一对^［2，3］，由美国Cybersyn公司合成。PCR扩增反应混合物包括：1×PCR buffer，上下游引物各25 pmol，50 μmol/L dNTP，5%二甲基亚砜，150～250 ng模板DNA。反应条件：94 ℃ 45秒，62 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒，共35个循环。反应开始时94 ℃ 1分钟，结束时72 ℃延伸5分钟。PCR反应完毕，取5 μl反应产物，1 μl上样缓冲液，于含0.5 μg/ml溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，以100 bp梯度DNA为分子量标准。紫外灯下观察，若在相应位置有清晰扩增带，则照像并保留进行单链构象多态性（SSCP）分析。若无特异扩增标本，可能为纯合性缺失，进行内参对照基因β-actin的扩增，进一步确证。

3.p16基因第1外显子甲基化状态的检测：在两个0.5 ml离心管中加入0.75～1.00 μg模板DNA，再各加入10×限制性内切酶反应缓冲液1 μl，内切酶EcoR I 10 U，混匀，37 ℃ 孵育2小时。 再分别加入内切酶Hpa Ⅱ、Sac Ⅱ 10U，混匀，37 ℃ 孵育2小时。为使酶切完全，再加入EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ(或Sac Ⅱ)各10U，37 ℃，4小时。取酶切后及未酶切的DNA各50 ng进行p16基因第1外显子扩增反应。反应体系及条件同前。取5 μl反应产物，分别做常规1.5%琼脂糖凝胶电泳检测及聚丙烯酰胺凝胶电泳。后者电泳完毕进行常规银染反应。将未经酶切的DNA与经HpaⅡ或SacⅡ酶切的DNA在相同条件下扩增、电泳和银染，作为阳性对照。与未酶切的标本相比较，特异扩增带无明显减弱者为甲基化阳性，无阳性扩增带或经凝胶分析系统对比定量分析，阳性银染条带强度小于未酶切标本的10%，为甲基化阴性。

4.p16基因突变的PCR-SSCP检测：取PCR产物5 μl，上样缓冲液［含95%去离子甲酰胺，20 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠（EDTA），0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯腈］，100 ℃变性8分钟，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，4 ℃，50V，12～15小时，银染色分析结果。

5.p16基因PCR扩增产物的直接序列分析：采用Sanger双脱氧链终止法对p16基因PCR产物进行直接测序。根据fmol Tag测序试剂盒(Promega公司)进行测序。反应中止后，取3 μl反应液于8%变性聚丙烯酰胺凝胶内，用40W功率预电泳20分钟及电泳3小时，凝胶干燥后做放射自显影。

6.免疫组化和原位杂交检测分别采用文献［4，5］方法。

7.采用两样本率比较的χ²检验进行统计学处理。

结果

1．p16基因PCR扩增结果及纯合性缺失情况: p16第1外显子扩增产物为260个碱基，第2外显子上、下段两对引物扩增产物分别为244及242个碱基。β-actin扩增产物为366个碱基。用作对照的24例癌旁乳腺组织3对引物均扩增出目的DNA片段，确定无p16基因纯合或杂合性缺失。60例乳腺癌中，有7例纯合性缺失(11.7%)，位于第1外显子者1例，第2 外显子3例，其余3例第1、第2外显子上、下段均发生纯合性缺失(图1)。

M：标记物；1、2、4：病例号，见阳性扩增带；3：缺失

图1p16基因第2外显子琼脂糖凝胶电泳结果

2.p16基因第1外显子甲基化结果: 用限制性内切酶切割DNA后，进行p16基因第1外显子PCR扩增，其产物分别进行琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳、硝酸银染色。结果为：相应酶切位点有甲基化形成的标本，琼脂糖电泳显示特异性条带；聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后呈现明显的棕黑色条带，与未经酶切的DNA扩增产物相比，无明显差异，而无甲基化存在的标本，则无特异性染色带(图2)，或银染强度明显减弱，其产物量(银染强度)不及未经酶切DNA的10%。60例乳腺癌中，分别9例(15.0%)、7例(11.7%)在HpaⅡ、SacⅡ位点发生高甲基化，总共16例，占26.7%。而24 例癌旁乳腺组织在以上两个位点均未见高甲基化。两者p16基因甲基化率差异有显著性(P＜0.05)。乳腺癌有淋巴结转移和无淋巴结转移的病例中高甲基化率分别为41.9%(13/31例)和10.3%(3/29例)，差异有显著性(P＜0.05)。

N：未消化标本；M：甲基化标本；NM：无甲基化标本

图2p16基因第1外显子甲基化，PCR检测聚

丙烯酰胺凝胶电泳银染结果

3.p16基因PCR-SSCP分析结果：60例乳腺癌和24例癌旁乳腺组织，除7例纯合缺失病例有缺失的外显子外均进行了PCR产物的SSCP分析。共有4例乳腺癌检出p16基因突变，有3例发生于p16基因第2 外显子上段，1例发生于下段，第1外显子未见突变病例(图3)。24例乳腺癌旁组织未检出p16基因突变。4例p16基因突变的乳腺癌，3例发生淋巴结转移。

p16基因第2外显子