【摘要】目的了解伯基特淋巴瘤和EB病毒的关系及p53和bcl-2蛋白的表达。方法采用PCR、原位PCR及免疫组化LSAB方法,检测了28例伯基特淋巴瘤石蜡包埋的组织块。结果发现8例EB病毒DNA阳性,阳性率为28.5%, 8例阳性病例做了原位杂交, 其中3例为阳性。27例做了p53和bcl-2免疫组化检测,阳性病例各为12例(44.4%)和13例(48.1%)。Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期p53和bcl-2阳性病例分别为3例(23.0%)、9例(64.2%)和3例(23.0%)、10例(71.4%),两者均表现Ⅲ～Ⅳ期阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期。χ²检验: p＜0.05,差异有显著性。EB病毒、p53和bcl-2同时阳性的有4例, EB病毒和p53同时阳性的有5例, eB病毒和bcl-2同时阳性的有4例,p53和bcl-2同时阳性的(包括EB病毒、p53和bcl-2同时阳性的病例在内)共有9例,即EB病毒阳性的病例有半数以上合并p53和bcl-2阳性, 而p53和bcl-2则有70%左右阳性病例同时有阳性表达。结论肿瘤内EB病毒DNA阳性率和非洲型伯基特淋巴瘤不同,而和世界各地报道的散发型相似；肿瘤内p53和bcl-2表达Ⅲ～Ⅳ期明显高于Ⅰ～Ⅱ期; eB病毒、p53和bcl-2之间可能存在某些相互的影响。

The correlation between Burkitt′s lymphoma and Epstein-Barr virus in28 cases and their expression of p53 and bcl-2 proteinsLi Peijuan^*, cui Quancai, Wang Zhiyong, et al. ^* Department of Pathology, Beijing children′s Hospital, Beijing 100045

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation between Burkitt′s lymphoma and Epstein-Barr (EB) virus and its expression of p53 and bcl-2 proteins.MethodsPolymerase chain reaction (PCR), in situ PCR and immunohistochemical techniques were applied to specimens from 28 cases of Burkitt′s lymphomas on paraffin-embedded sections.ResultsEB virus was found in 8 (28.5%) cases by pCR, of which 3 were positive by in situ PCR. Positive rates for the expression of p53 and bcl-2 were 44.4% and 48.1% respectively. Whereas in stages Ⅰ-Ⅱ and Ⅲ-Ⅳ, they were 3(23.0%), 9(64.2%) and 3(23.0%), 10(71.4%) respectively. both the expression of p53 and bcl-2 were high in stages Ⅲ-Ⅳ, low in stagesⅠ-Ⅱ (P＜0.05). The positive cases of EB virus in combination with the expression of p53 and bcl-2 protein, p53 protein and bcl-2 protein were 4,5,4 respectively and 9 cases were positive for p53 and bcl-2 protein. In other words, the positive cases for EB virus in combination with the expression of p53 and bcl-2 were 50%, whereas 70% were positive for both p53 and bcl-2.ConclusionsThe positive rates of EB virus in our series are different from some reports of african-Burkitt′s and similar to many other reports of endemic Burkitt′s lymphoma. The expression of p53 and bcl-2 proteins are significantly correlated with stage; high in stages Ⅲ-Ⅳ and low in stages Ⅰ-Ⅱ. EB virus, p53 and bcl-2 proteins may affect each other.

【Key words】Burkitt′s lymphomaHerpsvirus 4, humanDNA, virualProtein p53Protein bcl-2

淋巴瘤是小儿时期最常见的恶性实体瘤之一，伯基特淋巴瘤又是小儿非Hodgkin淋巴瘤中较常见的一型，此瘤属于未分化型小无核裂细胞淋巴瘤。恶性度高，病变发展迅速，多数病人预后很差，国外曾有很多报道，国内报道不多。伯基特淋巴瘤与EB病毒的关系及其p53和bcl-2的表达报道不多^［1，2］，我们复查了北京儿童医院病理科从1956年至1991年小儿淋巴瘤的材料,将其中典型的伯基特淋巴瘤28例进行了临床病理资料的分析,用PCR方法将石蜡包埋的组织块进行了EB病毒DNA检测,并检测了肿瘤的免疫表型和p53及bcl-2蛋白的表达。

材料与方法

1.复查了1956～1991年54例伯基特淋巴瘤，挑选临床病理资料完整的28例进行以下各项检测。

2.EB病毒检测：DNA模板的提取：石蜡包埋组织,一次性刀片5 μm厚切片, 取3～5张蜡膜, 放入1.5 ml离心管中,常规二甲苯脱蜡, 梯度乙醇入水, 离心后组织用400 μl PK缓冲液悬浮,70℃水浴10分钟, 自然次序冷却后加蛋白酶K, 55 ℃消化3小时,等体积酚抽提,上清液加入2倍体积乙醇, 0.2 mol/LNASC沉淀, 12000r/min离心, TE重溶沉淀。(1) PCR扩增：30 μlPCR扩增体积中含PCR缓冲液,200 μmol/L dNTP, 50 pmol/L扩增引物(TC60:CCAGAGGTAAGTGGACTT, TC61: gACCGGTGCCTT CTTAGG, 北京医科大学生化系合成),0.2 μg模板DNA, 0.25 uTagDNA聚合酶, 经94 ℃1分钟, 55 ℃1分钟, 72 ℃ 1.5分钟扩增30个循环。电泳鉴定及Southern转印：0.8μl扩增产物, 经3%琼脂糖凝胶电泳后，20 μl阳性病例扩增产物经琼脂糖电泳,照像后, 经Southern转印至硝酸纤维素膜上后, 用α-P-dCTP标记EBV-Ban w核酸探针杂交后, 经严格冲洗, 放射自显影后观察结果。(2)原位杂交：对PCR扩增EBV检测阳性的8例进行原位杂交, Raji细胞为阳性对照,P-2细胞为阴性对照,石蜡包埋组织5 μm厚切片, 常规脱蜡脱水, PBS冲洗, 0.1 mol/L HCl10分钟后,蛋白酶K消化37 ℃10分钟, 梯度乙醇脱水, 42 ℃预杂交2小时后加杂交液40～80μl/片, 42 ℃过夜杂交, 严格冲洗后, 经脱水、自然干燥，涂核-4乳胶,放射自显影7～10天后, D-76显影、定影, HE复染观察。原位杂交探针标记：1850 kBq α-S-dCTP(杜邦公司), 随机引物标记方法标记EBV-BanW核酸探针(Promega公司标记盒)。

3.用免疫组化方法检测肿瘤的白细胞共同抗原(LCA), UCHL-1和L26,确定其免疫表型，p53和bcl-2蛋白, L26, UCHL-1, LCA和bcl-2为DAKO公司产品,p53为Santa cruz Biotechnology公司产品, STMP试剂盒为Zymed公司产品。p53和bcl-2在组织脱蜡复水后用0.01 mol/L枸橼酸钠水浴煮至90 ℃10分钟，自然冷却10分钟后进行LSAB法免疫组化染色(步骤略)。检测结果28例有1例肿瘤蜡块只剩边缘结缔组织,故取消, 只剩27例。阳性反应的评估:肿瘤细胞阳性观察标准：0%～25%为±,25%～50%+,50%～75%++，＞75%+++。

4.统计学处理用卡方(χ²)检验法。

结果

1.临床资料: 男21例, 女7例, 男女之比为3∶1。发病年龄以2岁至13岁,2～5岁10例, 6～9岁9例, 10～13岁9例。病变部位: 腹部13例,包括回肠7例(其中3例表现肠套叠症状和体征), 肠系膜淋巴结5例,腹腔1例; 颈淋巴结5例; 腹股沟淋巴结1例(其中1例伴有颅神经Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ损害和下肢瘫痪);鼻咽部2例; 纵隔1例。病期：根据Ann Arbor分期标准:Ⅰ期: 7例,表现为单纯的局部肿物。Ⅱ期: 6例,表现为局部肿物和附属淋巴结肿大。Ⅲ期和Ⅳ期: 14例, 有2个或2个以上部位肿块,伴有或无全身症状。

2.病理表现: 28例全部表现为典型伯基特淋巴瘤的病理形态,瘤细胞大部分为一致的小圆细胞, 核膜较厚, 核染色质粗糙,核仁清楚, 呈弥漫排列,肿瘤细胞之间可见星天状分布的巨噬细胞(图1),肿瘤细胞之间尚可见到点状或片状坏死。免疫组化染色：27例全部表现为B细胞免疫表型,阳性细胞除1例在50%以下外, 其余阳性表达在50%以上。

3.EB病毒检测：28例肿瘤DNA PCR扩增产物中有8 例在122bp有特异性扩增带,并经Southernblot证实产物为EBV-Ban w(图2，3), 阳性率为28.5%。8例阳性病例原位杂交结果, 3例阳性(图4)。阳性信号主要分布在肿瘤细胞胞浆及胞核内，信号强度不等,最多者50%。原位杂交阳性的3例, 2例发生于结外, 1例发生于结内。

4.p53检测结果：27例中12例表达50%以上有意义的阳性(图5),阳性率为44.4%,按病期分Ⅰ～Ⅱ期病人, 13例中阳性有3例,阳性率为23.0%,Ⅲ～Ⅳ期14例病人有9例阳性, 阳性率为64.2%。

5.bcl-2检测结果: 27例中13例表达50%以上有意义的阳性,阳性率为48.1%。按病期分：Ⅰ～Ⅱ期病人13例, 阳性3例,阳性率23.0%；Ⅲ～Ⅳ病人14例, 阳性病人10例, 阳性率71.4%。

6.p53和bcl-2检测结果：Ⅲ～Ⅳ期阳性率明显高于Ⅰ～Ⅱ期病人,χ²检验结果P＜0.05, 差异有显著性。

EB病毒、p53和bcl-2同时阳性4例, EB病毒和p53同时阳性5例, EB病毒和bcl-2同时阳性4例,即EB病毒阳性的病例有半数以上同时合并p53和bcl-2或其中之一阳性, p53和bcl-2同时阳性的

图1瘤细胞由大小一致的小圆细胞构成，核膜较厚，核染色质粗糙，核仁清楚，弥漫排列，瘤细胞之间散在星天状分布的吞噬细胞HE×800图5p53染色显示胞核内棕黄色阳性物质LSAB法×800

M1：pBR322/Hinf I Marker,Raji：阳性对照细胞(下同)，

1～8为病例号,M2:pBR322/BstN I Marker

图28例伯基特淋巴瘤PCR扩增产物凝胶电泳结果

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