【摘要】目的进一步了解EB病毒亚型在我国Hodgkin病中的感染情况。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法对已知EB病毒阳性的113例Hodgkin病和21例健康人咽部洗液标本进行了EB病毒核抗原基因(EBNA-3C)检测。结果68例Hodgkin病出现特异扩增带，其中A型EB病毒62例，B型6例；健康人咽部洗液标本中13例有特异.扩增带，其中A型EB病毒11例，B型2例。结论A型EB病毒是感染我国Hodgkin病的主要亚型。其原因可能不是A型EB病毒致病力强，更可能是由于我国健康人群中受A型EB病毒感染率高。

Detection of Epstein-Barr virus subtypes in Hodgkin′s diseaseZhou xiaoge^*, Li Peijuan. Ji Xiaolong, et al. ^* Beijing hospital，Beijing 100730

【Abstract】ObjectiveTo investigate Epstein-Barr virus (EBV) subtypes in Chinese patients with Hodgkin′s disease (HD).Methods113 cases of HD patients with EBV latent membrane protein 1 (LMP-1) and/or EBV encoded small RAN (EBER-1) positive and throat washings from 21 healthy persons were studied for EBV subtypes by polymerase chain reaction (PCR).Results68 hD cases exhibited specific bands, in which 62 cases were EBV type A and 6 cases were EBV type B. 13 of the control washing gave rise to specific bands, of which11 were EBV type A and 2 of EBV type B.ConclusionThe results showed that EBV type A is predominant in Chinese HD patients and healthy individuals.

【Key words】Hodgkin′s diseaseHerpsvirus 4, human Lymphoma

Hodgkin病是淋巴系统的一种恶性肿瘤，其病因长期受到人们关注。我们曾用免疫组化和原位杂交方法发现了Epstein-Barr virus(EB病毒)与我国Hodgkin病存在密切关系^［1，2］。现在我们采用聚合酶链反应(PCR)对EB病毒的亚型做进一步的研究，以弄清EB病毒亚型在我国Hodgkin病中的感染情况，为生产相关疫苗提供基础资料。

材料和方法

1.标本：从北京市儿童医院病理科、解放军总医院病理科、北京铁路总医院病理科、北京医院病理科、北京空军总医院病理科和内蒙古乌兰察布盟医院病理科1965年～1995年的病理标本中收集了156例Hodgkin病。除8例经Bouin液固定外，其余均由10%福马林固定和石蜡包埋。经EB病毒潜在膜蛋白抗原(LMP-1)免疫组化和EB病毒编码的小RNA(EBER-1)原位杂交检测，113例呈EB病毒阳性。其中67个阳性病例已发表^［1，2］，其余46例是新补充的阳性病例。我们着重对这113例EB病毒阳性标本进行了EB病毒亚型的检测。另外，收集了21例健康成年人咽部洗液作为正常人群对照。

2.试剂：(1)引物类型：EBNA-3C-3序列：5′-AGAAGGGGAGCGTGTGTTGT-3′；产物长度：A型153 bp。EBNA-3C-5序列：5′-CGGCTGCAGTTTTTGCT CGG-3′；产物长度：B型246 bp。此引物由德国Pharmacia Biotech公司合成，可同时扩增A型和B型EB病毒核抗原基因(EBNA-3C)^［3］。(2) dNTP：购自德国Pharmacia Biotech公司。(3)Taq酶、氯化镁、缓冲液购自美国Perkin-Elmer公司。

3.方法^［4］：(1)DNA提取：每例蜡块切4张10 μm切片。然后二甲苯两次55℃30分钟脱蜡，99%乙醇两次55℃15分钟除去二甲苯，两滴丙酮55℃30分钟干燥组织，0.28 mg/ml蛋白酶K55℃48小时消化组织，然后96℃20分钟灭活酶活性，最后离心取上清液做为反应模板。咽部洗液标本DNA的提取基本同上，只是无脱蜡过程。(2) pCR：反应混合物包括5 μl DNA模板、1.25 U Taq酶、0.2 mmol/L dNTP、25 pmol/L引物、2 mmol/L氯化镁、5 μl10×缓冲液及双蒸水加至50 μl。第一循环为热启动。即95℃5分钟变性、72℃2分钟(此时加入Taq酶)，57℃1分钟退火及72℃2分钟延长。然后再进行下面的40个循环：94℃1分钟、53℃2分钟及72℃2分钟。在最后一个循环中72℃持续10分钟。(3)电泳：6%琼脂糖(含溴乙淀0.5μg/ml)电泳，紫外光检测仪检测。检测标准：在153 bp出现扩增带定为A型，在246 bp出现扩增带定为B型。(4)对照：阳性对照包括已知的A型EB病毒细胞株(B_95-8)和B型EB病毒细胞株(EBV-2)；阴性对照包括无DNA模板的PCR反应混合物和无组织的蜡块。

结果

1.临床资料：在经LMP-1免疫组化和EBER-1原位杂交证实的113例EB病毒阳性病例中，男89例，女24例，男女比例为3.7∶1，年龄分布在3～80岁，平均12.77岁，14岁以下儿童占82%。

2.组织学类型：混合细胞型(MC)97例，结节硬化型(NS)10例，淋巴细胞削减型(LD)6例，无淋巴细胞为主型。

m：分子量标记；1：A型EB病毒阳性对照；2：B型EB病毒阳性对照；3～7：Hodgkin病；8，9：健康人咽部洗液标本；10：阴性对照；

附图Hodgkin病EB病毒PCR检测结果

3.EB病毒亚型：经过PCR检测，在113例EB病毒阳性病例中，68例出现了特异扩增带，即在153 bp处或在246 bp处出现了扩增带。A型占62例(91%)，其中MC 57例，NS3例，LD 2例；在年龄上，53例小于14岁，9例大于14岁。B型占6例(9%)(附图)，其中MC4例，NS 1例，LD 1例；4例小于14岁，2例大于14岁。45例无扩增带。未发现同时受两个亚型感染的病例。这45例无扩增带的病例，后来经人体珠蛋白基因检测仍未出现扩增带，提示这些病例中的DNA可能已断裂成小碎片。在21例健康人咽部洗液标本中，13例出现了特异扩增带，其中11例为A型，2例为B型。阳性对照在相应位置均出现了扩增带，阴性对照均无扩增带出现。

讨论

EB病毒分为两个亚型，A型和B型，亚型之间存在明显差异：(1)从基因结构上看，在EB病毒的一些基因组中(如EBNA-2，EBNA-3A，EBNA-3B，EBNA-3C和EBERs)存在碱基对的缺失或/和插入，因而在同组基因中形成了两种长度不等的序列，人们将其定为A型和B型。我们选用的引物正是检测EBNA-3C基因组的，其扩增产物的长度可有两种：153 bp和246 bp，前者为A型，后者为B型^［3］。(2)蛋白水平上的差异，如经B型EBNA-3基因合成的蛋白比经A型EBNA-3C基因合成的蛋白长77个氨基酸^［3］。(3)不同的蛋白结构引起不同的抗原抗体反应，因而用血清学方法可间接区分开A型和B型EB病毒感染。(4)在生物学上，B型EB病毒转化B淋巴细胞的能力较A型弱，因此建立B型EB病毒细胞株较困难。(5)从地区分布上看，A型遍布全球，B型多集中在非洲中部一带^［5］，但最近认为B型分布有所扩大。(6)从EB病毒相关疾病看，A型感染的疾病较广，B型则集中在部分非洲的Burkitt淋巴瘤、部分人体免疫缺陷病毒(HIV)阳性淋巴瘤和爱斯基摩人鼻咽癌中^［6，7］。

我们对感染我国Hodgkin病的EB病毒亚型进行检测的结果发现，91%的病例受A型EB病毒感染，9%受B型EB病毒感染。由此表明A型EB病毒是感染我国Hodgkin病的主要亚型。这一结果与EB病毒亚型在我国南方鼻咽癌中的感染情况(A型占15/16例)^［8］基本一致。

为了解A型EB病毒在我国Hodgkin病中感染占优势的原因，我们对21例健康人的咽部洗液进行了检测，结果A型占11/13例。Khanim等人^［9］也有类似的报道(9/10例)。这些结果表明EB病毒在我国健康人中的感染亦以A型为主。因此，A型EB病毒在我国Hodgkin病感染中占优势的原因可能不是因为A型EB病毒致病力较B型强，更可能是由于健康人中A型EB病毒感染的基数大所致。A型EB病毒在我国Hodgkin病和健康人中感染占优势的研究结果可供生产和使用EB病毒疫苗作参考。

参考文献

1Zhou XG, Hamilton-Dutoit S, Yan QH, et al. The association between Epstein-Barr virus and Chinese Hodgkin′s disease. Int J Cancer,1993,55：359-363.

2李佩娟，周小鸽，刘梓荣，等.小儿何杰金淋巴瘤与EB病毒的关系，中华病理学杂志，1994，23：224-226.

3Sample J, Young L, Martin B, et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. J Virol, 1990, 64：4084-4092.

4Sandvaj K, Peh SC, Andersen BS, et al. Identification of potential hot spots in the carboxy-terminal part of the Epstein-Barr virus (EBV) BNLF-1 gene in both malignant and benign EBV-associated disease: high frequency of a 30 bp deletion in Malaysian and Danish peripheral T-cell lymphomas. Blood, 1994,84：4053-4060.

5Zimber U, Adldinger H, Lenoir G, et al. Genograpgical prevalence of two types of Epstein-Barr virus. Virology, 1986,154：56-66.

6Boyle MJ, Sculley TB, Penny R, et al. The role of Epstein-Barr virus subtypes in human immunodeficiency virus-associatied lymphoma. Leuk Lymphoma, 1993,10：17-23.

7Abdel-Hamid M,