【摘要】目的探讨Hodgkin病(HD)Hodgkin/Reed-Sternberg(H/R-S)细胞的性质和来源。方法从8例HD冰冻切片上共提取H/R-S细胞68个，用IgH通用引物FRⅢa/J_H和κ、λ轻链家族性特异性引物行PCR检测。结果1例淋巴细胞为主型(LP)HD的H/R-S细胞重复出现IgH和V_κ4家族重排；2例结节硬化型HD(NSHD)中，1例H/R-S细胞有单次的IgH、V_κ4和V_λ3重排；1例有重复的V_κ4重排，单次的IgH和V_κ2、4重排；5例混合细胞型(MC)HD中，1例有重复的IgH重排，单次的V_κ3和V_λ4重排；1例有重复的V_κ4重排，单次的V_λ3和IgH重排；2例有重复的IgH重排和单次的IgH重排；1例有重复的IgH和V_κ3重排，单次的V_λ2、4重排。结论(1) LPHD的H/R-S细胞具有克隆性IgH和V_κ4基因重排，支持LPHD为B细胞克隆性增生的结论；(2) IgH和κ、λ基因重排的出现，提示NSHD和MCHD的H/R-S细胞来源于不同分化阶段的B细胞，可能为单克隆性，也有可能为寡克隆性增生。本研究的新颖之处在于：(1) 改进后的单个细胞PCR方法和Kppers等人的原方法相比较，能大幅度减少PCR的次数，节约试剂和时间；(2) 首次发现单个H/R-S细胞具有λ轻链基因重排。

Hodgkin′s disease: Ig gene rearrangements in single H/R-s cellsDeng Fei, Li Gandi, Yand Guang hua, et al. Department of Pathology, West China University of Medical Sciences, Chengdo 610041

【Abstract】ObjectiveTo investigate the origin and cell lineage of Hodgkin/Reed-Sternberg (H/R-S) cells from various subtypes of Hodgkin′s disease (HD).Methods68 single H/R-S cells were taken from frozen section of 8 cases of HD. The DNA from these single cells was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with immunoglobulin heavy chain gene FRⅢa/J_H primers and light chain family-specific primers.Results(1) IgH and V_κ4 rearrangements were repeatedly found in H/R-S cells from one case of lymphocytic predominant HD (LPHD). (2) Repeated and unique IgH and V_κ2,4 rearrangements were observed in 1 case of nodular sclerosing HD (NSHD) and unique IgH, V_λ3/V_κ4 rearrangements in another case of NSHD. (3) Repeated IgH/Vλ₃ and unique V_λ2,4 rearrangements, repeated V_κ4 and unique IgH/V_κ3 rearrangements, plus repeated IgH and unique V_κ3/V_λ4 rearrangements were detected respectively in 3 cases of mixed cellularity HD (MCHD). Repeated and unique rearrangements were found respectively in 2 cases of MCHD.ConclusionsThe H/R-S cells isolated from LPHD had monoclonal Igh and V_κ4 gene rearrangements, which supports the conclusion that LPHD is a monoclonal proliferation of B cells. The appearance of IgH and κ,λ gene rearrangement suggest that the H/R-S cells isolated from classical HD (MCHD and NSHD) originate from B lineage cells at various stages of differentiation.

【Key words】Hodgkin′s diseaseGene rearrangementPolymerase chain reactionHodgkin/Reed-Sternberg cell

长期以来，Hodgkin病(HD)的肿瘤性成分Hodgkin/Reed-Sternberg (H/R-S)细胞就一直引起病理学家的极大兴趣，但其性质和来源至今未有定论。造成这种情况的主要原因是H/R-S细胞在肿瘤组织中含量极少，H/R-S细胞识别标准难以统一，各种研究方法本身具有局限性。1994年，德国Kppers等^［1］直接从组织切片上提取单个H/R-S细胞并发现有IgH和Vκ基因重排，提示这些细胞来源于B细胞，为阐明H/R-S细胞的性质作出了重要贡献。但他们没有进行λ轻链基因重排的研究。目前尚未看到有关H/R-细胞λ轻链基因重排的报道，也未见到HD的研究为何多涉及κ轻链而不涉及λ轻链的详细解释^［2］。由于κ轻链和λ轻链基因重排在判断B细胞分化程度上有同等的重要性，所以，在目前无法了解经典HD(混合细胞型和结节硬化型，即MCHD和NSHD)的H/R-S细胞胞浆中为何能同时存在两种轻链蛋白的情况下，研究H/R-S细胞κ和λ轻链基因重排有相当的意义。我们以曾经建立的方法为基础^［3］，除采用IgH通用引物和κ轻链家族性特异性引物外，还采用了Kppers等人没有采用过的λ轻链家族性特异性引物，对提取的单个细胞进行IgH和κ、λ基因重排的研究，以进一步明确H/R-S细胞的性质和来源。

材料和方法

一 、材料

选自华西医科大学附属第一医院病理科1989年～1997年间诊断的HD淋巴结冰冻组织8例。其中，MCHD 5例，NSHD2 例，淋巴细胞为主型(LP)HD 1例。B细胞中心母细胞性淋巴瘤石蜡包埋组织1例作为阳性对照。

二、方法

1.单个H/R-S细胞的提取：详见参考文献［3］。

2.免疫组化：除CD30外，每一例石蜡切片均作κ及λ单克隆抗体(Dako公司)ABC法染色。

3.引物：(1) 重链基因引物^［4］由中国科学院上海细胞生物研究所合成。扩增片段长度约80～120 bp。(2) κ、λ轻链基因家族性特异性引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成^［5，6］。V_κ和V_λ家族性特异性引物和相应J区引物扩增片段长度约350 bp^［5，6］。其中，V_κ5和V_κ6、V_λ3a和V_λ3b、V_λ7和V_λ8分别按1∶1的比例混合使用；3′J_κ1、2、4，3′J_κ3和3′J_κ5按3∶1∶1的比例使用；J_λ1，J_λ2、3和J_λ6、7按1∶2∶1的比例使用，以减少反应次数。对V_λ5、₆、₁₀、₁₁和V_λ12家族目前未设计出相应引物。

4.聚合酶链反应(PCR)：(1) 单个细胞IgH扩增：在PE480 DNA热循环仪上进行。半巢式扩增。首轮循环体积25 μl(50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl pH8.4，0.01%明胶，2.5 mmol/L MgCl₂，dNTPs各200 μmol/L，FRⅢa/LJH各2.8 nmol/L，1U Taq聚合酶(上海复旦生物所)，热启动。95 ℃ 5分钟，61 ℃5分钟，72 ℃5分钟，后接40个循环，95 ℃1分钟，61℃ 30秒，72 ℃30秒。首轮循环产物不释释，取5 μl作为第二轮循环的模板。第二轮循环中，引物FRⅢa/VLJH各2.8 nmol/L。30个循环，95 ℃ 1分钟，62 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒，其余同首轮循环。。除将后接40个循环改为后接30个循环外，其余步骤同首轮循环。(2) 单个细胞κ、λ基因扩增：首轮循环体积25 μl(50 mmol/l KCl, 10 mmol/L Tris-HCl pH8.4, 0.01%明胶，2.5 mmol/L MgCl₂，dNTPs各200 μmol/L, β-珠蛋白基因引物^［3］和Vκ/V_λ混合引物以及3′Jκ混合引物或J_λ混合引物各2.8 nmol/L，1U Taq聚合酶)，热启动。首轮循环95 ℃ 5分钟，59 ℃ 4分钟，72 ℃ 80秒，后接40个循环，95 ℃ 90秒，59 ℃ 30秒，72 ℃ 80秒。首轮产物不稀释，取5 μl作为第二轮循环的模板。第二轮循环中，每种K_Jκ或V_Jλ引物和5′_Jκ混合引物各2.8 nmol/L。其余同首轮循环。95 ℃2分钟，61 ℃ 4分钟，72 ℃ 80秒，后接40个循环，95 ℃ 90秒，61 ℃ 30秒，72 ℃ 80秒，最后延伸10分钟结束。

5.对照：B细胞中心母细胞型淋巴瘤石蜡包埋组织，常规提取DNA并行PCR(条件同IgH扩增)。首轮产物稀释1 000倍作为第二轮扩增的模板。阴性对照不加DNA。κ、λ基因扩增取首轮产物10 μl点样，如果单个细胞DNA提取成功及β-珠蛋白基因扩增成功，则会出现268 bp阳性条带。无阳性条带者不作第二轮扩增。

6.结果观察：取10 μl产物作8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，110V，3～4小时，EB染色，紫外线观察仪观察并照相记录。

7.κ、λ家族性特异性引物对慢性淋巴结炎的检验性扩增：为检验引物的可靠性，以1例石蜡包埋的慢性淋巴结炎常规提取DNA作一次性PCR，条件同单细胞κ、λ轻链扩增的第二轮。每种Vκ和V_λ引物的扩增产物各取10 μl点样观察。

结果

1.对照：B细胞性中心母细胞型淋巴瘤DNA经FRⅢa/JH扩增后，在80～120 bp处出现宽度＜2 mm的清晰条带。＞124 bp处的条带为非特异性扩增产物^［7］。阴性对照未出现任何条带。

2.慢性淋巴结炎PCR结果：V_κ1，V_κ2，V_κ3，V_κ4，V_κ5，₆均出现350 bp的特异性条带；V_λ3，V_λ4，V_λ7、₈，V_λ9亦出现相同大小的特异带。

3.免疫组化结果：各例MCHD和NSHD的H/R-S细胞均表达κ、λ轻链以及CD30。LPHD的H/R-S细胞表达κ和λ轻链，不表达CD30。

4.单个H/R-S细胞重链