【摘要】目的研究CD44V6在大肠癌细胞系HT29、LoVo细胞中的表达及其对细胞骨架的影响，探讨CD44V6影响肿瘤转移的作用机理。方法应用原位分子杂交、免疫组化、免疫荧光定量分析的方法研究CD44V6在人大肠癌细胞中的表达，应用免疫荧光及共聚焦三维图像重构分析的方法,研究CD44V6对大肠癌细胞的细胞骨架的影响。结果CD44V6在HT29、LoVo细胞中均有表达，不管在mRNA水平还是在蛋白质水平,高转移能力的LoVo细胞表达CD44V6均高于低转移能力的HT29细胞。将HT29、LoVo细胞用CD44V6单抗封闭则发现CD44V6能使HT29、LoVo细胞的细胞骨架发生改变。结论CD44V6的表达与大肠癌细胞的转移潜能有关。CD44V6可能通过影响大肠癌细胞骨架的构像和分布，从而影响大肠癌细胞的运动能力，影响大肠癌转移。

Expression of CD44V6 and its effects on cytoskeleton in human colorectal carcinoma cell linesLi Zuguo, Ding Yanqing, Deng Yongjian, et al. department of Pathology ,First Military Medical University,Guangzhou 510515

【Abstract】ObjectiveTo observe the expression of cD44V6 and its effects on cytoskeleton in human colorectal carcinoma(HCC) HT29 and LoVo cell lines.MethodsExpression of CD44V6 variant in hCC HT29 and LoVo cell lines was investigated by in situ hybridization, immunohistochemistry and quantitative immunofluorescence technique. The effects of CD44V6 variants on cytoskeleton was studied by immunofluorescence and confocal 3 dimension reconstruction technique.ResultsCD44V6 was expressed at the mRNA and protein levels in both HT29 and LoVo cell lines, but the expression was higher in LoVo cells than in HT29 cells. When the HT29 cells and LoVo cells were blocked by monoclonal antibodies, it was found that changes developed in the cytoskeleton of these cells.ConclusionsThe expression of CD44V6 is related to the metastatic potentiality of human colorectal carcinoma cells. CD44V6 may affect the distribution, polymerization and depolymerization of actin of HCC cells and promote HCC cell metastasis.

【Key words】Colonic neoplasmsReceptors, lymphocyte homingNeoplasm metastasisActinsTumor cells, cultured

CD44V6是最早发现与肿瘤转移有关的CD44的变异体,它与肿瘤侵袭、转移有关^［1］。但CD44V6的表达与大肠癌转移的关系及其作用机制尚未明确。我们采用原位分子杂交、免疫组化、免疫荧光定量分析的方法,分析了大肠癌细胞CD44V6的表达与其转移潜能之间的关系。并应用共聚焦图像三维重构技术研究了CD44V6对细胞骨架的影响。

材料与方法

一、 材料

1.细胞株：高转移能力的大肠腺癌(LoVo)、低转移能力的大肠腺癌(HT29)细胞株均由本教研室自存，培养于含20%的小牛血清的RPMI-1640培养液中，置37℃5%的CO₂培养箱中培养。

2.试剂：CD44V6寡核苷酸探针由上海细胞生物所赛尔公司合成,探针序列为：5′-TGAGAT tGGGTTGAAGAAATC-3′，地高辛寡核苷酸探针标记试剂盒、地高辛寡核苷酸探针检测试剂盒购自Boehringer公司。CD44V6蛋白单克隆抗体(BBA-13)购自英国R＆D公司。LSAB试剂盒(DAKO公司)购自福州迈新公司。

二、方法

1.细胞培养及细胞片制作：HT29、LoVo细胞采用RPMI-1640完全培养基培养，置于37℃含5%CO₂培养箱内，取指数生长期的细胞用2.5%胰酶(含0.01%EDTA)消化，制成浓度为1×10⁷个/ml的细胞悬液。将此细胞悬液一滴接种于已消毒培养皿中的盖片上，加完全培育基培养48小时，然后将细胞生长状态良好的盖片取出，用0.01 mol/L PBS，pH7.2（以下均简称PBS）漂洗3次。甲醇∶丙酮(1∶1)固定液固定10分钟。

2.原位分子杂交分析：将制好的细胞片用10 μg/ml蛋白酶K消化，37℃，10分钟；PBS洗2分钟2次；10%缓冲多聚甲醛后固定10分钟；PBS洗2分钟2次。取200μl预杂交液95℃变性10分钟，速置冰粒中骤冷，加样于细胞标本上；平放入密封湿盒，42℃孵育3小时。取已标记地高辛的CD44V6寡核苷酸探针10μl加预杂交液200 μl构成杂交液，将杂交液95℃变性10分钟，冰粒骤冷加样于细胞标本上，平放入密封湿盒内，42℃恒温过夜。依次用6×SSC－45%甲酰胺洗10分钟，2×SSC洗10分钟2次，0.2×SSC洗10分钟2次。加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Fab段（1∶500稀释），37℃4小时；洗脱液(0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，0.05 mol/L MgCl₂) 洗10分钟；洗后加NBT/BCIP显色液（NBT/BCIP30 μl， 洗脱液1000 μl）显色2小时。镜检显色情况，用PBS冲洗，终止显色反应。经100%酒精，二甲苯处理，中性树胶封片，保存。结果判断：采用阳性记分法：在显微镜下分别随机计数300个细胞，用（-）、（＋）、（＋＋）、（＋＋＋）表示细胞内mRNA表达强度：（－）不着色、（＋）细胞浆内细小稀疏蓝色颗粒、（＋＋）细胞浆内较密的细小蓝色颗粒、（＋＋＋）细胞浆内明显致密的蓝色颗粒。将结果按下面公式计算。细胞mRNA表达积分=（＋）%×1＋（＋＋）%×2＋（＋＋＋）%×3。

3.免疫组织化学检测：将培养在盖片上的HT29、LoVo细胞取出，用PBS漂洗3次，每次1分钟，95%酒精固定3分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，0.3%H₂O₂甲醇固定真空负压（6660kPa，以下同）条件下处理10分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，20%山羊血清真空负压10分钟，加 cD44V6蛋白单克隆抗体（1∶125）真空负压条件处理10分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，加二抗，真空负压条件处理10分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，加LSAB复合物，真空负压条件处理10分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，DAB显色10分钟，PBS漂洗终止显色，苏木素衬染、脱水、透明、封片。显微镜观察、照相。

4.免疫荧光半定量分析：将培养于盖玻片上的HT29、LoVo细胞取出，用PBS漂洗3次，每次1分钟，10%缓冲福马林固定5分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，加 cD44V6蛋白单抗真空负压条件处理10分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，加FITC标记的羊抗鼠IgG（1∶50）真空负压条件处理10分钟，PBS漂洗3次，每次1分钟，75%中性缓冲甘油封片，用共聚焦激光显微镜检测。应用ACAS master Program（V3.24）程序，选用同一参数，每种细胞随机选取6～8个视野约300个细胞进行分析。该仪器使用激光激发细胞内标记的荧光素使之发出荧光，通过光转换装置，观察荧光物质在细胞内的分布,应用计算机图像分析系统，进行定量分析和统计比较。

5.CD44V6影响HT29、LoVo细胞actin分布的免疫荧光检测：将指数生长期的HT29、LoVo细胞用胰酶消化，制成浓度为5×10⁵/ml的细胞悬液，实验组细胞悬液加CD44V6单克隆抗体（1∶100稀释），对照组加等量双蒸水。将细胞悬液接种于盖玻片上，置37℃、5% cO₂孵育箱内孵育24小时。将盖片取出，PBS漂洗3分钟，室温下用10%缓冲福马林固定10分钟，PBS漂洗3分钟，用滤纸吸干多余的PBS，投入冷丙酮中（－20℃）7分钟，PBS漂洗3分钟，加入actin单克隆抗体（1∶40），37℃恒温孵育180分钟，PBS漂洗3分钟，加 fITC标记羊抗兔IgG（1∶50），37℃恒温孵育180分钟，PBS 漂洗3分钟，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察，照相。

6.细胞骨架荧光图像共聚焦三维重构分析：将上述制好的细胞片，用570共聚集激光显微镜激光共聚焦程序分析检测，570共聚焦显微镜能从X、Y、Z三方向进行激光断层扫描，然后通过计算机对图像进行重构分析，可得出细胞内荧光物的不同断层构像和立体构像。以对细胞骨架构型变化进行分析。

结果

1.CD44V6在HT29、LoVo细胞系中mRNA水平表达检测：原位分子杂交实验结果显示：HT29、LoVo两种细胞系均有CD44V6 mRNA阳性信号表达。HT29细胞浆内均见有较稀疏的蓝色信号颗粒，HT29细胞mRNA信号表达强弱较一致（图1）。LoVo细胞胞浆内见致密的蓝色信号颗粒，分布较弥漫，部分细胞信号表达明显增强（图2）。HT29细胞CD44V6 mRNA表达量低于LoVo细胞，两者阳性表达的积分比为HT29∶LoVo=1.03∶2.56。

2.CD44V6在HT29、LoVo细胞系中蛋白水平表达检测：(1)免疫组化结果：HT29、LoVo两种细胞系均表达CD44V6蛋白。HT29细胞主要在细胞膜上表达，表达强度较一致(图3)。LoVo细胞表达强度不一致，较幼稚的细胞强阳性表达，而且胞浆内亦有

图1HT29细胞胞浆内有蓝色的CD44V6信号颗粒原位杂交×400图2LoVo细胞胞浆内有致密的蓝色CD44V6信号颗粒原位杂交×400图3HT29细胞膜上有一致的CD44V6表达LSAB法×400图4LoVo细胞膜及胞浆内有CD44V6表达，部分细胞强阳性表达LSAB法×400图5对照组HT29细胞actin较集中地分布于细胞核周围，似“环状”结构×400图6实验组HT29细胞actin呈解聚状态，荧光强度减弱，actin在细胞核周集中分布的现象消失，并且散在分布于细胞浆内×400图7对照组LoVo细胞actin较集中地分布于细胞核周围，似“环状”结构，周围胞浆内呈细网状均匀一致的分布×400图8