【摘要】目的研究肝细胞癌(HCC)中整合素α5、β1亚基和纤维连接蛋白(FN) mRNAs表达的生物学意义。方法应用Northern印迹杂交和核酸原位杂交技术，对15例HCC癌组织、5例癌旁肝硬化和3例正常肝组织中整合素α5、β1亚基和FN mRNAs表达作杂交分析。结果高分化HCC癌组织中三种mRNAs表达水平与癌旁及正常肝组织相近，而低、中分化HCC癌组织内明显减少，甚至消失(分别P＜0.01)；整合素α5亚基和FN mRNAs主要见于癌细胞胞浆内；HCC伴肝内浸润和/或转移组癌组织内三种mRNAs水平较无浸润转移组显著下降(P＜0.05)；5例伴肝内转移的HCC癌组织中FN mRNA呈异质性表达。结论HCC中整合素α5、β1和FN蛋白的表达变化系癌细胞基因转录水平下调的结果，可能与HCC细胞分化、浸润和转移相关；异质性FN mRNA及其编码的FN蛋白可能在HCC转移中有意义。

Expression of integrin α5,β1 subunit and fibronectin mRNAs in human hepatocellular carcinomaZhao Jingmin, Zhai Weirong, Zhang Yue′e, et al. Department of Pathology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032

【Abstract】ObjectiveTo sutdy the biologic significance of the expression of integrin α5, β1 subunit and fibronectin (FN) mRNAs in hepatocellular carcinoma (HCC).Methods Integrinα5,β1 subunit and FN mRNAs were detected by using Northern blot (α-³²P-labeled cDNA probes) and in situ hybridization (Dig-labeled cDNA probes) in 15 cases of hCC, 5 cases of paracancerous cirrhotic liver and 3 cases of normal liver tissue.Results In well-differentiated HCC, the level of integrinα5, β1 or FN mRNA expression was similar to those in normal liver and paracancerous cirrhotic liver tissues, but was markedly decreased, even absent in the poorly-and moderatedly-differentiated HCC tissues (P＜0.01, respectively). The expression of integrin α5 and FN mRNAs was mainly detected in the cytoplasm of HCC cells. In all the HCC cases tested, the expression of integrin α5,β1 and FN mRNAs was lower in 8 cases of HCC with focal invasion and/or intrahepatic metastasis than that in the others without invasion or metastasis(P＜0.05). In addition, the heterogeneous expression of FN mRNA was found in 5 cases of HCC with intrahepatic metastasis.Conclusions Combined with the immunohistochemical observation before, it might be deduced that the changes of integrin α5β1 and FN protein expression in HCC tissues are because of changing of the mRNA levels related, which might deeply influence the cell differentiation, tumour invasion and metastasis of HCC. The appearance of the heterogeneous FN mRNA and its encoded FN protein might be associated with the development of HCC metastasis.

【Key words】Liver neoplasmsExtracellular matrix proteinsIntercellular adhesion molecule-1RNA, messengerTranscription, genetic

从蛋白水平对人体肝细胞癌(HCC)组织中整合素α5、β1和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)定位和定量观察显示，两种蛋白表达的变化可能与HCC分化、浸润及转移关系密切^［1］ 。鉴于HCC中整合素α5、β1亚基和FN基因转录方面的研究少见，我们应用Northern印迹杂交和核酸原位杂交技术作HCC及癌旁肝组织中整合素α5、β1亚基和FN mRNAs表达的研究，旨在从分子生物学角度探讨其基因转录水平的变化在HCC生物学特性中的意义。

材料与方法

1.标本来源、处理及分组：15例HCC癌组织、5例癌旁肝硬化组织(3例活动性，2例非活动性)和3例正常肝组织(肝血管瘤远离部位)取自我校中山医院1994年4月～1995年6月手术切除标本，取一份于干冰-异戊烷内速冻后，-70℃保存抽提RNA用；一份入10%缓冲福马林固定，常规石蜡包埋后，连续切片，作核酸原位杂交及HE染色。在15例HCC中，高、中和低分化组各5例。另据有、无镜下肝内浸润和转移，将HCC分成两组：HCC伴肝内浸润和/或转移组8例；无肝内浸润转移组7例。

2.Northern印迹杂交：按Chomczynski等^［2］方法抽提组织总RNA，所得RNA样品各取15 μg，经甲醛变性凝胶电泳后作Northern印迹转膜。用α-³²P-dCTP 随机引物法标记α5 、β1 cDNA探针（长度分别为3.1kb和3.0kb，重组质粒由美国Ruoslahti E教授馈赠^［3］，所制备探针鉴定见图1）和FN cDNA探针(探针长度1.4kb，Gibco BRL公司)作Northern印迹杂交^［4］。杂交膜片经去除目的杂交探针处理后，用同位素标记的磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) cDNA探针(中科院细胞生物研究所提供)再次杂交作阳性参照。

注：M：标准分子量(λ DNA/Hind Ⅲ)，1：α5重组质粒，2：α5重组质粒酶切片段，3：α5 cDNA探针，4：β1 cDNA探针，5：β1重组质粒酶切片段，6：β1重组质粒

图1整合素α5、β1 cDNA探针酶切鉴定

3.核酸原位杂交：以随机引物法Dig标记整合素α5 cDNA探针(0.9 kb，Gibco BRL公司)和FN cDNA探针(同上)，用漂片法作原位杂交。主要步骤为：石蜡切片厚8 μm，用新鲜二甲苯及酒精脱蜡水化，4%多聚甲醛，0.1 mol/L PBS后固定。依次入0.1 mol/L PBS(pH7.2)、含0.1 mol/L甘氨酸的0.1 mol/L PBS、含0.4% Triton X-100的0.1 mol/L PBS漂洗。1.5 μg/ml蛋白酶K，37℃孵育30分钟，含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS 5分钟，0.1 mol/L PBS洗片后入0.25%乙酸酐(0.1 mol/L三乙醇胺配制)10分钟， 2×SSC 10分钟，将切片移入杂交液(50%去离子甲酰胺，0.1% 十二烷基肌氨酸、0.02% SDS、0.2% Blocking Reagent和250 g/ml变性鲑鱼精 DNA)，杂交液内探针浓度均为0.5 μg/ml，42℃，振荡杂交16小时。切片经梯度SSC和0.05 mol/L PBS漂洗后，加AP标记的抗Dig抗体Fab片段(浓度1∶800)，37℃，40分钟，室温1小时，分别用TSM1液(0.1 mol/L pH8.0 Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L MgCl₂ )和TSM2液(0.1 mol/L pH9.5 Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl、50 mmol/L MgCl₂ )漂洗，NBT/BCIP显色，裱片后，恒温箱干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，阳性杂交信号为蓝色颗粒。设阴性对照：(1)25 μg/ml RNA酶预处理切片后杂交；(2)无探针杂交。

4.图像分析及统计学处理：采用MIAS-300图像分析系统及TJTY-300(同济太阳公司)图像分析软件，对Northern印迹杂交后X光片上的杂交信号作面积和平均光密度测定，并用同一样品的GAPDH阳性信号值加以校正。计算公式为：阳性信号校正指数=样品阳性信号面积×样品阳性信号灰度值/GAPDH阳性信号面积×GAPDH样品阳性信号灰度值。参照以前的免疫组化定量方法^［1］，测定整合素α5 和FN mRNAs原位杂交阳性指数(positive index，PI)。采用方差分析作统计学处理。

结果

1.整合素α5 、β1和FN mRNAs表达的Northern印迹杂交结果：整合素α5 mRNA位于28S稍后4.9 kb处呈一阳性条带(图2)；整合素β1 mRNA 在28S前4.2 kb处呈一阳性条带(图3)；FN mRNA主要在28S后8 kb处呈一阳性条带，但5例HCC组织除8 kb处外，在5 kb处可见另一清晰的阳性条带(图4)。HCC癌组织中整合素α5 、β1和FN mRNAs表达水平因分化程度而异(图5)。低、中分化组整合素α5 、β1和FN mRNAs含量均值皆明显低于高分化组及癌旁和正常对照组(分别P＜0.01)，而后两组间无显著性差异。低分化组与癌旁和正常对照组比较，整合素α5 、β1 和FN mRNAs下降幅度分别为86.5%、60.3%和90.8%。HCC伴肝内浸润和/或转移组三种mRNAs表达水平均明显低于不伴肝内浸润转移组(分别P＜0.05)。 此外，Northern印迹杂交显示5例 HCC组织在5kb位置FN mRNA呈异质性表达，组织学观察发现该5例HCC虽然分化程度不同(2例高分化和3例低分化)，但均有肝内门静脉内癌栓形成。

H：高分化，M：中分化，L：低分化，C：癌旁肝组织

图2HCC、癌旁肝硬化及正常肝组织整合素

α5 mRNA Northern印迹杂交结果

H：高分化，M：中分化，L：低分化，C：癌旁肝，N：正常肝

图3HCC、癌旁肝硬化及正常肝组织整合素

β1 mRNA Northern印迹杂交结果

H：高分化，M：中分化，L：低分化，C：癌旁肝，N：正常肝

图4HCC、癌旁肝硬化及正常肝组织整合素

FN mRNA Northern印迹杂交结果

2.整合素α5 和FN mRNAs表达的原位杂交结果：正常肝组织中表达较高水平的整合素α5和FN mRNAs，两者杂交信号阳性肝细胞分