【摘要】目的通过检测肺鳞状细胞癌及癌旁肺组织中p53蛋白积聚及相同癌组织中p53基因的突变，探讨p53蛋白积聚及p53基因突变在肺鳞癌发病中的意义。方法采用免疫组化和银染-PCR-SSCP方法检测120例肺鳞癌及癌旁肺组织中p53蛋白的状况及相同肺鳞癌组织中p53基因5、6、7、8外 显子突变的情况。结果p53蛋白阳性率为52.5%(63/120例)，p53基因突变率为56.7%(68/120例)，突变例数在第5、6、7、8外显子的分布依次为24例(35.3%)，11例(16.2%)，18例(26.5%)，15例(22.1%)。综合两种检测方法所得结果，p53基因突变/过度表达率为60%。中、低分化癌组p53基因突变/过度表达率(中分化癌组63.6%，28/44例；低分化癌组63.5%，40/63例)显著高于高分化癌组(30.8，4/13例)，局部淋巴结转移组p53基因突变/过度表达率(80%，44/55例)显著高于无局部淋巴结转移组(43.1%，28/65例)，进展期(Ⅱ～Ⅲ期)肺鳞癌p53基因突变/过度表达率(76.3%，45/59例)显著高于早期(Ⅰ期)肺鳞癌(44.3%，27/61例)，重度吸烟组p53基因突变/过度表达率(72.4%，55/76例)显著高于非吸烟组(38.6%，17/44例)；p53基因突变/过度表达率与患者性别、年龄、肿瘤发生部位及周围组织浸润无关。结论p53基因突变/过度表达在肺鳞癌发生、发展中可能发挥重要作用，p53基因突变/过度表达可作为判断肺鳞癌患者预后的指标之一。

Detection of the p53 protein accumulation and p53 gene mutation in squamous cell carcinoma of the lungLi sufeng, Liu Hongrui, Wang Detian. Department of Pathology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100730

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of p53 protein accumulation and p53 gene mutation in the pathogenesis of squamous cell carcinoma of lung.Methods Immunohistochemistry and PCR-SSCP techniques were used to detect p53 protein accumulation and p53 gene mutation.Results p53 protein accumulations was found in 52.5% (63/120) of the samples. p53 gene mutation was detected in 56.7% (68/120) of the same speciments by pCR-SSCP. In 24 cases (35.3%, 24/68), the mutations was locating on exon 5, 11 cases (16.2%, 11/68) on exon 6, 18 cases (26.5%, 18/68) on exon 7 and 15 cases (22.1%, 15/68) on exon 8 respectively. The rate of p53 gene mutation/overexpression was 60%. p53 gene mutation/overexprssion rate of moderately (63.6%, 28/44) or poorly (63.5%, 40/63) differentiated pulmonary squamous cell carcinoma was significantly higher than that of the well differentiated carcinoma (30.8%, 4/13). In comparing with non-lymph node metastasis group (43.1%, 28/65), p53 gene mutation/overexpression rate in metastasis group (80%, 44/55) was significantly higher. p53 gene mutation/overexpression rate of pulmonary squamous cell carcinoma in advanced stage (76.3%, 45/59) was significantly higher than that in the early stage (44.3%, 27/61). p53 gene mutation/overexpression rate in heavy smoking group (72.4%, 55/76) was significantly higher than that in non-smoking group (38.6%,17/44). No statistically significant correlation was found between p53 gene mutation/overexpression and sex, age, tumor location or invasion of the surrounding tissue.Conclusions p53 gene mutation/overexpression may play an important role in the pathogenesis of spuamous cell carcinoma of lung and can be considered as a predicting marker of prognosis.

【Key words】Lung neoplasmsProtein p53Immunohistochemistry

p53基因是重要的肿瘤抑制基因，许多人类肿瘤都伴有不同程度的p53基因突变。既往研究提示，肺肿瘤的发生、发展与p53基因突变有一定关系。目前，有关大样本肺鳞癌与p53基因突变/过度表达关系的研究资料有限。我们采用免疫组化和银染-PCR-SSCP方法 检测120例肺鳞癌及癌旁肺组织中p53蛋白积聚和p53基因的突变，并结合临床病理资料进行分析，探讨p53基因突变/过度表达在肺鳞癌发病中的意义。

材料和方法

一、标本

120例肺鳞癌及癌旁肺组织为北京协和医院病理科1988～1995年存档之外科手术标本。所有患者术前均未接受化学药物治疗及放疗。

二、免疫组化

抗p53单克隆抗体pAb1801及SP免疫染色试剂盒为Zymed公司产品。石蜡切片脱蜡、水化后，0.01 mol/L PBS(pH7.4)洗5分钟，3次；3%H₂O₂-甲醇孵育5～15分钟，PBS5分钟，2次；过双蒸水；组织切片置柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，微波加热15分钟以修复抗原，凉至室温；PBS洗5分钟，3次；滴加10%山羊血清，15分钟；倾去血清，滴加1：50稀释的抗p53单克隆抗体，4℃过夜；PBS冲洗3次，每次5分钟，滴加1∶100稀释的生物素化二抗，室温30分钟；PBS洗，加 1∶100稀释的辣根酶标记的链霉卵白素，30分钟；PBS冲洗3次，每次5分钟；DAB显色；苏木素复染；树脂封片。

三、银染-PCR-SSCP

p53基因第5、6、7、8外显子特异PCR扩增引物购自北京中山生物技术有限公司。

1. 分别扩增p53基因第5、6、7、8外显子，正常人外周血白细胞DNA为正常对照，50 μl反应体系中含1×PCR缓冲液，2.5 mmol/L，MgCI₂，200 μmol/L dNTP，100 pmol/L引物，1 μg模板DNA，1U Taq DNA聚合酶。循环设置如下：95℃预变性3分钟，94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 20秒，35个循环，72℃ 延伸10分钟。

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：取15 μl PCR产物加30 μl甲酰胺变性缓冲液，180伏恒压电泳3～4小时。凝胶经固定、染色、显影、定影后，灯箱上观察并照相。

四、统计学方法

χ²检验。

结果

一、临床病理资料

120例肺鳞癌患者年龄范围31～79岁，平均56.4岁，男∶女为16∶1(113/7例)；重度吸烟(每日吸烟20只或以上，连续吸烟20年或以上)者76例，不吸烟者44例(其中3例患者吸烟，但远达不到重度吸烟标准，数量少，无法进行统计学分析，故归入不吸烟组)；120例肺鳞癌中，浸润胸膜、膈肌、肋骨30例；伴局部淋巴结转移55例；中央型肺癌86例，周围型肺癌34例；高分化癌13例，中分化癌(包括中～高分化癌)44例，低分化癌(包括中～低分化癌)63例；Ⅰ期肺鳞癌61例，Ⅱ～Ⅲ期肺鳞癌59例。

二、肺鳞状细胞癌中p53基因过度表达及p53基因突变结果

120例肺鳞癌中p53蛋白阳性63例(52.5%，图1)，120例癌旁肺组织均未发现p53蛋白；p53基因5、6、7、8外显子突变68例(56.7%，图2)，其在第5、6、7、8外显子的分布依次为24例(35.3%)，11例(16.2%)，18例(26%)，15例(22.1%)。二种方法检测均阳性者59例，均阴性者48例，68例p53基因突变者中有9例免疫组化检测p53蛋白阴性，免疫组化检测阳性而PCR-SSCP检测阴性者4例。两种方法检测p53基因突变/过度表达共72例。

图1免疫组化检测p53蛋白积聚结果阳性信号为

棕褐色颗粒，均位于肿瘤细胞核内

1：阴性对照(正常人外周血白细胞DNA)，2～8：肺鳞癌组织DNA，ssDNA：单链DNAdsDNA：残存的双链DNA↑：为异常泳动带

图2银染-PCR-SSCP检测p53基因第5外显子突变结果

三、p53基因突变过度表达与肿瘤细胞分化程度、局部淋巴结转移、肿瘤临床分期及吸烟有关

中、低分化癌组中p53基因突变/过度表达率(中分化癌组63.6%，28/44例；低分化癌组63.5%，40/63例)显著高于高分化癌组(30.9%，4/13)，局部淋巴结转移组p53基因突变/过度表达率(80%，44/55例)显著高于无局部淋巴结转移组(43.1%，28/65例)，进展 期(Ⅱ～Ⅲ期)肺鳞癌p53基因突变/过度表达率(76.3%，45/59)显著高于早期(Ⅰ期)肺鳞癌(44.3%，27/61)，重度吸烟组p53基因突变/过度表达率(72.4%，55/76例)显著高于非吸烟组(38.6%，17/44例)。p53基因突变/过度表达与患者年龄、性别、肿瘤发生部位及周围组织浸润无关。

讨论

我们采用免疫组化技术检测120例肺鳞癌及癌旁肺组织中p53蛋白的积聚，所用抗p53蛋白单克隆抗体pAb1801既能识别突变型p53蛋白也能识别野生型p53蛋白。但一般认为野生型p53蛋白的半生期很短，正常组织细胞中p53蛋白的水平很低，免疫组化技术检测不到，突变型p53蛋白不仅稳定性增加、半生期延长，并于核内积聚，免疫组化技术可以检测量到^［1］。因此应用pAb1801抗体检测到的p53蛋白绝大部分应为突变型p53蛋白。本实验中63例p53蛋白阳性者均为肺鳞癌组织，而120<