军事医学科学院院刊2000年第24卷第3期

何昆张德添张学敏杨怡张飒汪宝珍

摘要综述了生物组织细胞三维重建技术的方法，重点讨论了连续超薄切片的三维重建技术及其在生物医学研究中的应用前景。

关键词：生物组织；三维重建技术；超薄切片

随着生物医学的发展，人们已经意识到由于生物体在生理、病理上的变化，将会对细胞器的形态产生一定的影响；反之，通过对细胞器形态的观察，从一定程度上也可以反映生物体在生理、病理上的改变。

物体切片二维参数为人们提供了物体某一截面的二维信息。如果将物体不同截面上的二维图像按照截面的空间关系依次排列，便可组成物体的三维数据。连续切片的计算机三维重建技术是对某一细胞结构进行连续超薄切片，然后把这一系列切片的图像，通过计算机进行处理，从而得到该细胞结构的立体形态的一种方法。在利用计算机图像处理理论、图形生成理论以及视觉心理学，在二维平面上形象地显示物体的三维图像，这就是计算机三维重建过程^［1］。

目前，生物组织连续切片的三维重建工作国内已经开展，但大多数仅停留在光镜水平上，电镜水平的三维重建报道甚少。人们对细胞器的观察大多停留在二维水平上，无法直观地观察它的立体构象，往往只能凭借个人的经验在观察了大量的二维图像后在头脑中“重建”起来的。这无疑会影响最终结果的客观性和全面性。

随着计算机技术的飞速发展，图像处理中三维重组技术日趋完善，同时高分辨电子显微学也向着更精确的定量化发展，这就使观察细胞器的三维构象成为可能。

1连续切片技术

1.1消除变形方法

研究表明，固定可引起组织收缩，甲醛(福马林)使组织收缩30%，组织切片漂浮在水面也会引起变形^［2,3］。故水温应恒定，漂浮时间相同。染色的次数和种类也会影响结构形态。因此，在实际过程中应尽量减少变形的影响。

1.2定位方法

系列切片必须准确定位，此过程称为图像对位。该步骤旨在防止切片进行性平移对位错误，即在X、Y轴上基准线移位，在Z轴上，基准线旋转^［4］。基准线对位的各种方法都是对位标记或计算机覆盖，各种对位标记包括用特定结构进行包埋，并沿着该结构进行切片。例如，沿着长神经纤维包埋，或垂直于切片平面的石蜡块手工或激光打孔贯穿整个包块^［5～8］，有时在孔中插入神经纤维或包埋以前以仙人掌茎刺穿过组织，包埋于石蜡块中。国外也有人用偏振光照射，通过双折射可以清晰地定位^［4］。还有人提出使用边界定位的方法也可以得到很好的结果^［2］。

1.3切片技术

切片的数量越多，获得的空间三维信息越多，所重建的三维图像也越接近实际，但计算量也随之增大^［7］。另外，细胞器的直径大小不一，一般情况下在零点几到几个微米之间，而一张超薄切片的厚度在50～80 nm，因此，考虑选取较大的细胞器，连续切片10～20张，进行重建。

1.4数据输入方法

欲对图像进行处理，首先要将其转化为数字信号，通常有两种方法：一种是组织切片经显微放大，由摄像机摄取并直接由A/D转化为数字图像存入计算机^［2,9,10］；另一种是将显微图像用照相机摄为底片，通过手工绘制或计算机扫描等方法，转化为数字信号，存入计算机。

1.5重建结构的分离和校准方法

通常从图像各成分中选取的欲重建结构需要放大，常用的方法有手工绘制和计算机处理两种方法。前者即通过投影仪放大，在硫酸纸上绘制轮廓^［11］。优点是^［4］：在三维重建以前，通过绘制过程，可以了解结构中各成分的界限以及相互联系；绘制可参照另外结构在不同时间内重建的内部结构；绘制易行，不需要其他特殊的设备。而缺点是耗时费力，且主观因素多。另一种方法是使用计算机处理法。对于感兴趣的结构可以用图像处理的方法自动分段，如设立阈值来显示感兴趣的结构或描记组织界限。

2二维图像的处理技术

2.1图像的增强技术^{［10～14］}

为了突出感兴趣的目标，即所要重建的细胞器，需要对数字图像进行预处理^［10］。采用的方法主要有：对比度的增强和图像的锐化^{［12～14］}。前者主要是充分利用整个灰度范围，增强图像的对比度，主要有线形灰度变换、非线形灰度变换、直方图平坦化等方法；后者主要是使图像轮廓变得清晰，采用的方法主要有高通滤波，但采用高通滤波会增强噪声，因此，在此之前需要平滑噪声。

2.2噪声平滑技术^{［12～15］}

图像在生成和传输过程中经常受到各种噪声源的干扰和影响而使图像质量变差，为了抑制噪声，改善图像质量，必须对图像进行平滑处理。在平滑噪声的同时，要注意保持边界的清晰^［2］，通常采用的技术是中值滤波^{［9,12～14］}。

2.3特征提取技术

该步骤是将感兴趣的目标（欲重建的细胞器）与其他目标相分离，即从二维图像中提取细胞器的信息^{［10,16,17］}。常用的技术有阈值分割和边缘检测^{［1,3,12，18］}。

3三维重建技术

3.1内插技术^［19］

在切片等制作技术过程中，由于技术条件的影响，图像会出现不连续的现象，这就会造成三维图像的失真。利用生物组织的图像信息内在的密切空间相关性，用插值的方法（插值算法、线形插值、动态线形插值等^{［19～21］}）对图像进行修复。

3.2重建技术

有了足够多的组织断面信息，就可以进行三维重建了，目前三维重建的技术方法很多^{［1,8,16,18］}，主要有：

(1)线框图形法。将切片中物体的轮廓线提取出来组成经纬线，产生网状结构的三维物体图形，直观效果差^［22］。

(2)立体图对法。将不同深度层次的组织切片轮廓线按照视差原理重叠在一起，然后用双眼对视镜对重叠图像聚焦而获取三维图像^［7,15］。

(3)灰度表面模型法。首先利用多边形（通常为三角形）逼近物体表面，再通过隐面消影，明暗处理等方法获得一个立体感强的三维物体图像。直观效果好，计算量大^{［2,21～23］}。

(4)体素模型法。以体素（像素）作为三维图像的基本单元，其特点是保留了重建物体的内部特征，便于做剖面观察，但直观效果差^［12,23］。

(5)深度彩色法。对切片图像进行彩色分割，即利用不同颜色对不同组织结构图像进行编码，并对不同层次的组织块赋予不同的颜色、饱和度和亮度，利用颜色由浅到深给人以由近及远的深度感觉。适合于单一结构或黑白图像^［11］。

(6)真实立体图像显示法。利用光学原理和人眼的视觉暂留特性的重建方法。

此外，研究人员根据自己的研究对象、实验条件等实际情况，提出了很多适合自己研究的重建方法^{［1,12,24～28］}，这些方法各有所长，都是针对不同研究对象和目的提出的，有一定的适用范围，这要求我们对这些技术进行反复比较，并加以改进，最终可以快速地得到正确结果。

3.3后处理^［10,23］

重建后的图像，往往由于重建技术的原因，造成图像在连接处的不光滑，因此，需要对其表面进行平滑处理^［2］。通常使用的技术方法是低通滤波^{［12～14］}。

4生物组织细胞三维重建技术方法在生物医学研究中的应用

三维重建技术在阐明生物组织细胞结构与生理、病理功能之间关系以及在形态学、生理解剖学、细胞化学定位等生物医学领域研究中有着重要的意义。

生物组织的计算机三维重建技术已经在国内外开展了一些研究，但目前大都集中在光镜水平以及使用激光共聚焦扫描显微镜^{［29～31］}。在超微结构水平则大多使用体视学的方法^［32,33］，如海军医学研究所使用该技术研究了正常大鼠心肌细胞、肝细胞核及线粒体等的形态参数在乙醇作用下的毒理学改变。也有在二维图像上通过傅立叶变换以及反傅立叶变换对原物体进行三维重建^{［34～36］}，该方法适用于病毒等对称性颗粒的组织^{［37～40］}，而不适合复杂的细胞器的三维重建。连续切片的细胞器三维重建工作，目前在国外已经开展，Baheerathan等^［5］利用连续系列超薄切片成功地对肝细胞的细胞核进行了三维重建。

5讨论

到目前为止连续切片的计算机三维重建，多数是对肉眼观察到的实体，如脑、颅骨、脏器等^［5］。显微生物组织图像的计算机三维重建还是一