中华普通外科杂志2000年第15卷第7期

刘连杰王颢景在平孟荣贵

关键词：大肠癌 微转移 基因检测 肿瘤标志物

转移是恶性肿瘤的重要特征，也是癌症患者死亡的主要原因。大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前对其局部原发肿瘤，采取手术为主的治疗方法基本可以控制，但根治术后肿瘤的复发和转移率高达50%左右^［1］。早期认识有无肿瘤转移、转移方式及范围对临床诊断、治疗及预后判断具有重要意义。近年来随着免疫学及分子生物学的发展，使大肠癌的微转移检测成为可能。

一、微转移的概念

自1869年首次在外周血中发现癌细胞以来，肿瘤微转移逐步引起人们重视。人们发现早期大肠癌可有远处转移，借助活体显微电视系统更可直接观测到手术中癌细胞播散，特别是“无淋巴转移”的Dukes b期患者中，有近30%5年内死于局部复发或远处转移，提示淋巴系统或全身存在微转移^［2,3］。

微转移一般指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝、肺等组织器官中的微小肿瘤细胞灶，常无任何临床表现，常规检查方法如CT、MRI、单抗放射显影技术、普通病理检查等都很难发现^［3］。

微转移的肿瘤细胞常以单个细胞或微小细胞团形式经淋巴系统、血液系统转移至淋巴结、骨髓和其他组织器官，也可直接侵袭周围组织或种植于体腔。

二、大肠癌微转移与临床转移的关系

除非在非常晚期，临床转移一般都由微转移发展而来。而微转移只有少数才能发展为临床转移。微转移发展为临床转移至少经过4步^［2］：(1)微量肿瘤细胞自原发灶脱离；(2)适应新代谢环境，逃避机体免疫；(3)侵袭远处组织；(4)在新组织中新血管生成，肿瘤生长。微转移的转归取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官微环境。动物实验表明，血循环中至少有10⁴个肿瘤细胞才可出现显性转移，多数肿瘤细胞发生凋亡，少数进入休眠状态，极少数发生增殖。淋巴结、血循环、骨髓中存在微转移，提示肿瘤不再局限于原发灶，有发展为远处转移瘤的可能，但微转移灶可长期处于G₀期或增殖与死亡处于平衡状态。只有当机体遭受种种打击或免疫力下降时，休眠的肿瘤细胞才摆脱抑制状态而持续增值，并发展为临床显性转移。

三、大肠癌微转移的检测方法

微转移的检测方法有多种。连续切片是最早用于检测淋巴结微转移的一种简单方法，对常规检测阴性的淋巴结进行连续切片检查，可使淋巴结转移的检出率提高14％～24％。但此方法工作量大，粗糙，且不适用于血循环、骨髓的微转移检测。

免疫组化、免疫荧光检测实用有效，应用较广。选用针对大肠癌细胞标志物的抗体，对组织切片、细胞涂片进行染色，以寻找各种组织中的肿瘤细胞。Lindemann等^［4］应用APAAP法对88例大肠癌患者行术前骨髓组织单克隆CK18检测，癌细胞阳性检出率达32％，部分呈簇状分布，部分呈单细胞分布。其他角蛋白单抗、CEA、CD₄₅等也可单独或联合应用。该方法简便、直观，还可用于鉴别肿瘤病理来源。缺点是易遗漏、需连续切片，单抗的质量、交叉反应等因素影响检测的敏感性和特异性。

此外，放射免疫检测、流式细胞分析技术也具有重要应用价值。

四、基因检测大肠癌微转移

基因检测方法是通过对肿瘤标志物进行PCR、RT-PCR检测来诊断微转移。PCR技术由Mullis1985年发明并荣获诺贝尔奖。1991年Smith等^［5］首次应用PCR技术检测到血循环中存在转移的瘤细胞。之后PCR技术被广泛应用于微转移研究。PCR、RT-PCR检测具有高度敏感性、特异性，理论上可准确检测1g组织或1ml液体中的1个癌细胞，被认为是目前检测微转移的最有效方法。

肿瘤标志物种类众多^［2］。(1)特异性基因：包括染色体的异常、基因点突变、基因缺失等等。正常组织一般不伴有这些改变，检测相关特异性基因可诊断微转移。如p53、ras、DCC、erb-B2等等。(2)肿瘤特异性标志物：指在肿瘤细胞中存在而在正常细胞中不存在，如CEA、AFP。(3)组织特异性标志物：指在肿瘤起源组织中存在，而在其他组织中不存在，特别是在淋巴细胞和血细胞中不存在，如角蛋白20(cytokeratin,CK20)。(4)转移特异性基因。（5）肿瘤伴随的病毒。

五、基因检测微转移方法的比较

利用任何一种标志物都可能建立一种检测微转移的方法，理想的标志物应同时具备敏感性、特异性。

Hayashi等^［3］1995年采用PCR对120例常规诊断无转移的大肠癌患者淋巴结进行K-ras、p53基因突变检测，发现存在淋巴结微转移。但各类大肠癌细胞中K-ras、p53的突变率仅为50％左右，该方法敏感性较低。CEA是一个良好血清学指标，但有报道，可有23%的健康人群CEA mRNA表达阳性。

细胞角蛋白是分布于外胚层起源细胞的中间纤维丝，包含多个成员，CK20由Moll等^［6］于1990年发现，含424个氨基酸，相对分子质量为48553，CK20不同于其他细胞角蛋白，它非常局限在胃肠上皮细胞，正常淋巴组织、血液组织、骨髓组织中不表达。大肠癌中高表达，且在肿瘤侵袭、转移、扩散到其他组织器官时始终保持稳定。在非上皮组织中检测到CK20提示存在肿瘤细胞。Bostick等^［7］分别对大肠癌患者、乳腺癌患者、正常人、良性疾病患者淋巴结进行CEA、CK19、CK20、肿瘤相关抗原733.2（GA733.2）、粘蛋白1（MUC-1）的mRNA RT-PCR联合检测，发现组织学检查为阴性的淋巴结中有40％左右已经有微转移。而在正常人外周血和淋巴结中只有CK20无表达，其他标志物都有不同程度的假阳性。认为CK20是检测肠癌微转移的既特异又敏感的良好标志物。

六、大肠癌微转移检测的临床应用

可监测大肠癌区域淋巴结微转移。Dorudi等^［8］研究了18例中期大肠癌患者162枚区域淋巴结，应用CK20 rT-PCR检测发现，21％的Dukes B期患者已有淋巴结微转移，实属Dukes c期，认为检测该方法可协助准确分期。

可监测大肠癌血循环中的微转移。Funaki等^［9］检测了28例大肠癌患者外周血CK20 mRNA，8例复发患者和4例伴远处转移患者均为阳性，5例CK20 mRNA表达阳性但无复发或转移的Dukes c患者在随访到11个月时有3例复发，11例正常人或良性患者外周血CK20 mRNA均为阴性。Funaki认为微转移可能是Dukes B期患者术后复发的主要原因，外周血CK20 mRNA表达是预测大肠癌复发和转移的实用指标。还有学者对65例大肠癌患者围手术期血循环微转移进行动态监测，发现手术增加转移机率。

可监测大肠癌骨髓中的微转移。Soeth等^［10］用套式RT-PCR检测了57例大肠癌患者骨髓的CK20 mRNA表达，发现CK20阳性表达率与肿瘤分期紧密相关，Ⅰ期0％,Ⅱ期24%,Ⅲ期31%,Ⅳ期71%。Soeth等^［11］检测了胃肠肿瘤患者的141份骨髓标本和104份静脉血标本，发现骨髓检测微转移较外周血敏感、稳定，两者吻合率为87％。

可监测大肠癌腹腔微转移。Vogel等^［12］对90例大肠癌患者行剖腹后立即用100ml温盐水局部冲洗的方法，腹腔冲洗液进行检测，常规细胞学发现肿瘤细胞发现率为35.5%。而利用一种糖蛋白抗体进行免疫组化检测，阳性率提高到47.2%。并且认为腹腔微转移与患者肝转移密切相关。Vogel认为该方法检测微转移，敏感性较高，特异性强。

七、大肠癌微转移的意义

有研究表明，37例伴淋巴结微转移的大肠癌患者中有27例5年内复发，而34例无微转移的患者，无1例复发^［3］。另有报道，骨髓中CK20 mRNA表达阳性的大肠癌患者2年内死亡率为60％，表达阴性患者同期死亡率为11％，两者差别很明显^［11］。微转移是一个独立的预后指标，其价值优于Dukes分期和肿瘤分级。但也有报道认为，微转移与预后无关^［13］。对于血循环微转移的诊断争议最大，不仅因为可能存在假阳性^［14］，而且临床转移所需的最小肿瘤细胞数量级为10⁴，远远高于基因诊断为微转移的细胞数量^［2］，故基因诊断的血循环微转移可能对患者预后影响不大，基因检测的高敏感性可能降低了其临床应用价值。一些学者认为，基因诊断为微转移的细胞成分非常复杂^［2］，特别在骨髓中，肿瘤标志物表达阳性的细胞可能不是肿瘤细胞。

尽管近年来对于检测大肠癌微转移的研究取得了很大进展，但一些标志物(如CK20)的分子行为、基因特征还有待进一步研究，微转移的确切意义值得商榷，与预后的确切关系有待观察。正常人、慢性胰腺炎患者、肝腺瘤患者分别出现外周血、骨髓CK20表达阳性，从而怀疑CK20的特异性^［14］。对低分化、未分化大肠肿瘤的基因检测研究较少。许多实验结果相差较大，可能与技术方法、病例选择不同有关。PCR检测费用昂贵，限制了其广泛临床研究，对早期诊断意义也不大。相信随着对微转移检测的认识和不断研究，将建立更科学的检测方法，揭示微转移的机制，明确微转移与复发、临床转移、生存期的关系，从而带来诊断、治疗的根本变化。