中国医科大学学报2000年第29卷第1期

李异玲王天骄傅宝玉

摘要目的：探讨一氧化氮(NO)在实验化学性肝纤维化中的作用。方法：选用Wistar纯系大白鼠，通过皮下注射四氯化碳复制肝纤维化动物模型。于注射12周后将已经发生肝纤维化的大白鼠随机分成两组，一组尾静脉注射NO合成酶抑制剂L-NAME，另一组注射生理盐水作为对照，4周后检测血清NO浓度及肝脏病理改变。结果：血清NO浓度在肝纤维化过程中呈升高趋势，尾静脉注射L-NAME后，血清NO浓度下降，病理检查提示L-NAME组较生理盐水对照组纤维组织增多，纤维间隔增宽。结论：NO不但参与了化学性肝纤维化过程，并在此过程中起到抑制纤维化发展的作用。

关键词：一氧化氮化学性肝纤维化一氧化氮合成酶抑制剂

自从1987年发现内皮衍生舒张因子的本质是一氧化氮(nitric oxide,NO)以来^［1］，NO在生物学界越来越引起重视。NO在许多疾病中发挥的血管舒张作用已得到认可。最近的研究发现，NO与肝细胞损伤亦有关，王根生^［2］等研究表明NO在急性免疫性肝损伤中起保护作用，而在急性化学性肝损伤中作用甚微。本研究探讨NO在慢性化学性肝损伤——肝纤维化中的作用。为肝纤维化发病机理的研究及抗肝纤维化新药的研制提供新的思路。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：Wistar纯系大白鼠42只均为雄性，体重100～120 g。正常组7只，实验组35只，由中国医科大学实验动物部提供，分笼饲养，按昼夜时程及室温条件下，用平衡饲料喂养。

1.1.2试剂及设备：四氯化碳，α-奈胺盐酸盐，对氨基苯磺酸均为国产分析纯。NO合成酶抑制剂N^G-硝基-左旋精氨酸甲基乙酯(L-NAME，Sigma公司)。氢氧化铝凝胶由1 mol/L硫酸铝与6 mol/L氢氧化钠等体积混合，离心洗涤后制成。仪器有日本岛津260分光光度仪，国产漩涡混匀器，低速离心机。

1.2方法

1.2.1实验化学性肝纤维化动物模型的制备：对于实验组动物，将40%四氯化碳花生油混合液按1.2 ml/kg皮下多点反复注射，每周2次，并于注射4、8、12周后分批处死动物，每次7只。12周后，将余下的大白鼠尾静脉分别注射L-NAME(25 mg/kg)及生理盐水，4周后处死，所有动物均颈静脉切开采血，剖腹取肝，进行检测。

1.2.2NO水平的测定：参照文献［3］略加修改，用α-奈胺分光光度法检测血清NO含量：取新鲜血清0.6 ml，经氢氧化铝凝胶脱色后，依次加入3.2 mmol/L对氨基苯磺酸，3.2 mmol/L α-奈胺盐酸盐，0.1 mol/L乙酸钠各0.5 ml，30 min内，波长520 nm测定光密度值。

2结果

2.1肝脏病理改变正常：肝细胞以中央静脉为中心向外周呈放射状分布。4周：肝脏呈点状坏死，脂肪变性，空泡变性。8周：肝脏呈大片状坏死，纤维组织增生，但尚无完整纤维间隔形成。12周：纤维组织明显增多，形成较完整纤维间隔。

2.2血清NO水平的变化血清NO正常值为(16.2±1.4)μmol/L，注射四氯化碳4周后为(26.4±1.2)μmol/L，8周时为(37.3±1.9)μmol/L，12周时(54.8±1.5)μmol/L，较正常组明显增高(P＜0.01)。尾静脉注射生理盐水4周后NO升为(42.2±1.1)μmol/L，尾静脉注射L-NAME 4周后，血清NO值为(17.5±1.4)μmol/L，较生理盐水组显著下降(P＜0.01)。

尾静脉注射L-NAME后肝脏病理改变与生理盐水组相比，汇管区纤维组织明显增多，纤维间隔增宽，见图1、2。

图1尾静脉注射生理盐水4周后肝脏病理改变×10Figure 1Pathology of liver after injection of normal saline via tail vein(4 weeks)×10

图2尾静脉注射L-NAME 4周后肝脏病理改变×10Figure 2Pathology of liver after injection of L-NAME via tail vein (4 weeks)×10

3讨论

肝硬化严重威胁人类健康，而肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段，它是在外界致炎因子的作用下，使胶原的生成与降解失衡，从而导致细胞外基质(ECM)的过度沉积，能否将病变终止于肝纤维化阶段，对于慢性肝病的防治，具有重大意义。

NO是一种新的细胞间信息交换的载体，广泛参与生理功能的调解。它在体内以左旋精氨酸为底物，在NO合成酶的作用下，脱去胍基末端氮原子而生成。NO与消化系统疾病关系密切，它可作为非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经的一种递质，在胃肠道自主神经支配方面起主要作用。可调节胃粘膜血流，维持粘膜的完整性和防御能力^［4］，促进溃疡的愈合，降低平滑肌张力。本实验通过皮下注射四氯化碳复制化学性肝纤维化动物模型，探讨NO在肝纤维化中的作用，结果表明，随着肝脏病理改变的加重，血清NO水平明显升高，由(16.2±1.4)μmol/L上升到(58.4±1.5)μmol/L，这一结果说明了NO在化学性肝纤维化中起到一定作用。为了研究其作用方式，对于已经发生肝纤维化的大白鼠，尾静脉给予NO合成酶抑制剂L-NAME 4周后，NO水平明显下降，降至(17.5±1.4)μmol/L，病理学检查发现使用抑制剂后，汇管区纤维组织明显增多，纤维间隔增宽，这一结果表明NO起到了抑制纤维化发展的作用，并且随着肝纤维化程度的加重，NO发挥的抗肝纤维化作用也越来越明显。生理盐水对照组，NO浓度降至(42.2±1.1)μmol/L，其病理改变较第12周减轻，说明NO水平与肝纤维化程度相平行。临床上需寻求提供NO的药物来抗肝纤维化，硝普钠、硝酸甘油能提供NO，乙酰胆碱能刺激内源性NO的释放，都有一定的应用前景。但对于NO的抗肝纤维化机制，有待于进一步研究。

王天骄（基础医学院生物化学教研室)

李异玲（中国医科大学第一临床学院消化内科，沈阳 110001）王天骄（中国医科大学第一临床学院消化内科，沈阳 110001）傅宝玉（中国医科大学第一临床学院消化内科，沈阳 110001）

参考文献

1，Palmer RMT,Ferrige AG,Moncade S,et al.Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium derived relaxing factor.Nature,1987,327(6122):524-526

2，王根生，刘耕陶.一氧化氮在小鼠肝损伤中的作用.中华医学杂志，1996，76(3)：203～206

3，李恩民，许丽艳，李琳，等.α-奈胺分光光度法检测血清中一氧化氮含量.分析化学，1995，23(8)：979～980

4，Plque JM,Esplugnes JV,Whittle BJR,et al.Endogenous nitric oxide as a mediator of gastric mucosal vasodilatation during acid secretion. Gastroenterology,1992,102(1):168-174