中华外科杂志2000年第38卷第1期

张兴凯杨庆铭邓廉夫朱雅萍

摘要：目的：改良成人成骨细胞消化培养方法，以满足在细胞学水平进行骨代谢性疾病研究的需要。方法：取无菌骨碎片，先用胰蛋白酶消化多次，以去除血细胞和成纤维细胞；骨片经短期培养后，再次使用胰蛋白酶消化，得到大量纯净成骨细胞。细胞长至汇合后生成黑色结节。分别采用NPP底物法、¹²⁵I标记放射免疫(RIA)法和Ⅰ、Ⅲ型胶原顺序沉淀抽提、SDS－PAGE还原电泳法测定细胞上清中成骨细胞主要特征性分泌物：大量碱性磷酸酶(AKP)、骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原。结果：黑色结节经四环素染色，荧光显微镜下观察为骨结节特征性的金黄色。成骨细胞上清中AKP分泌量为(2.76±0.56) IU/ml、OCN分泌量为(1.875±0.549) ng/ml，明显高于成纤维细胞(P＜0.01)。可检测到Ⅰ型胶原而无Ⅲ型胶原。结论：此改良方法可以在短期内得到大量性状稳定成骨细胞，同时避免成纤维细胞混入。

关键词：成骨细胞碱性磷酸酶骨钙素胶原

成骨细胞特征性表型为分泌骨钙素(OCN)、大量碱性磷酸酶(AKP)和Ⅰ型胶原,而无Ⅲ型胶原分泌^［1］。我们采用改良骨组织消化培养方法，将骨片经短期培养后,再用胰蛋白酶消化,加快骨细胞的释放。经形态学观察及特征性分泌物检测证实,获得成骨细胞数量多，并与纤维细胞有明显区别。

材料与方法

一、液体的配制

0.25%胰蛋白酶用trypsin(1:250 DIFCO,Detroit,Michigan)溶解于d-Hank's液，抽滤灭菌。培养液使用DMEM+HAM F12 1∶1混合液(GibcoBRL,Grand Island,NY),加20%灭活新生牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml。低血清培养液为5%灭活新生牛血清，其余同培养液。使用25 cm²培养瓶(NUNCLON,Denmark)。

二、骨组织片消化

取骨科手术中获得的无菌骨碎片,彻底去除骨膜及软组织；用无菌Hank′s液冲洗3次,剪碎至体积小于1mm³；Hank′s液多次冲洗至骨片发白,放入锥形瓶内,加入0.25%胰蛋白酶(骨碎片10倍体积),37℃水浴中消化(30 min×5),去掉上清。剩余骨片浸泡于培养液中,置37℃ CO₂培养箱内2～3 d后,吸出培液,加入0.25%胰蛋白酶,37℃水浴中消化30 min,上清液经尼龙网过滤后,离心10 min(1000 r/min),去掉上清液,沉淀物用培养液打匀,接种于25 cm²培养瓶内,重复3次,直至离心后无沉淀物为止。

将消化后的骨片浸泡于培养液中,2～3 d后,重复上述胰蛋白酶消化步骤,仍有细胞释放,根据所需细胞量,可重复数次。接种后培养瓶内培养液较浑浊,10 h后即有贴壁细胞,72 h后,细胞完全贴壁,可冲洗、换液。此后隔日换液。取第二、三代细胞，消化后，以1×10⁵/ml浓度接种于培养瓶中，每瓶4 ml,5 d后换低血清培养液6 ml，24 h后收集上清液，分装于5个离心管内，-18℃保存,用于检测。

三、成骨细胞特征性鉴定

以皮肤成纤维细胞作为对照，鉴定实验所得成骨细胞。

1.形态学观察:除常规形态学观察外，采用趋骨性荧光素标记细胞培养生成结节。细胞培养瓶内加入四环素,使终浓度为50 μg/ml,培养箱内培养1 h,换新鲜培养液培养1 h，经Hank′s液冲洗3次,乙醇梯度脱水,固定,Olympus-Vanox-T显微镜落射荧光观察。

2.成骨细胞上清液AKP检测:采用磷酸对硝基苯酯二钠盐(p-Nitrophenyl phosphate disodium salt,NPP,上海丽珠东风公司)比色法^［2］,无色p-NPP与AKP在37℃水浴中反应生成黄色对硝基苯p-Nitrophenol,经405 nm波长比色,测得OD值,换算成国际单位。

3.成骨细胞上清液中骨钙素检测:采用BGP放免试剂盒(北京东亚免疫技术研究所)检测^［3］。根据放射免疫竞争结合原理，¹²⁵I标记OCN和样品所含OCN与OCN抗体竞争结合，使用分离剂使结合抗体沉淀，4℃离心后，γ计数器测定沉淀物cpm数，根据标准品曲线得到样品OCN含量。

4.成骨细胞上清液中胶原抽提及检测:采用中性、酸性Nacl溶液顺序沉淀抽提^［4］，SDS-PAGE垂直板还原电泳法^［2］。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝胶板固定于垂直板电泳槽^［5］。电泳液为0.05M Tris、0.38M甘氨酸、0.01%SDS(pH=8.8)；样品液为0.125 M Tris、15%甘油、2 M尿素、2%SDS、0.001%溴酚兰；染色液为0.25%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇和10% HAC；脱色液为5%异丙醇和8%HAC。样品解冻后,放55℃水浴中变性1 h,加入样品缓冲液50 μl,每个样品点2孔,每孔加样20 μl,另加Ⅰ、Ⅲ型胶原标准品,50 mA恒定电流电泳1 h后,每个样品第1孔内加入100 μl 20%β巯基乙醇(β-mercaptoethanol，Sigma)样品缓冲液,静置1 h后,13 mA恒定电流电泳12 h,染色液染色1 h,脱色液脱色24 h,拍照片。

四、统计方法

使用Statpal软件包,对所得数据进行t检验。

结果

1．形态学观察：骨组织消化后所得细胞接种于培养瓶，10 h后,开始有梭形贴壁细胞；72 h后,细胞全部贴壁,并伸出生长突，可见细胞呈梭形或鳞片状生长,细胞表面分泌物较多(图1)；1周后,细胞开始呈现成骨细胞形态,多数呈鳞片形,体积较大,多伪足,胞浆丰富,胞核较大,偏于一侧,有2～3个核仁^［6，7］,一般2～4周至汇合(图2)；继续培养,可见局部多层生长,并有黑色结节生成(图3)。经四环素标记,荧光显微镜观察,为金黄色亮区,证实为骨结节(图4)。透射电镜下观察,培养细胞体积较大,长方形或方形，约40 μm,胞浆丰富,内含大量粗面内质网，呈旺盛分泌相。

图1胰蛋白酶消化后72h贴壁成骨细胞相差显微镜×100

图2培养3周后长至汇合成骨细胞相差显微镜×100

图3成骨细胞多层生长后形成黑色结节相差显微镜×100

图4结节经四环素染色后，荧光显微镜下呈现金黄色×100

2．成骨细胞上清中AKP检测：24 h成骨细胞上清中，AKP分泌量为(2.76±0.56) U/ml，高于成纤维细胞分泌量(1.96±0.23) U/ml。两者相比，差异有显著性意义(P＜0.01)。

3．成骨细胞上清中骨钙素检测：24 h成骨细胞上清中，OCN分泌量为(1.875±0.549)ng/ml，亦高于成纤维细胞分泌量(1.190±0.591)ng/ml，差异有显著性意义(P＜0.01)。

4．胶原检测：成骨细胞有大量Ⅰ型胶原分泌,无Ⅲ型胶原分泌；成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原均有分泌。

讨论

一、成骨细胞体外培养方法的建立

早在20世纪60年代,Peck和Birge^［8］开始用胶原酶消化骨片,体外培养成骨细胞获得成功；1975年,Wong等^［9］采用多次胶原酶消化,使培养的成骨细胞得到纯化。1985年,Robey和Termin等^［10］采用低Ca²⁺培养液培养骨片获得成骨细胞,经过鉴定,比酶消化法得到的细胞更加纯化。本实验改良上述方法,先使用比胶原酶更便宜的胰蛋白酶进行多次消化,胰蛋白酶仅能消化骨小梁表面细胞周围的基质，而对于埋藏于骨基质中的大量静止骨细胞无作用。前5次胰蛋白酶消化液中含有骨组织中残留的血细胞、成纤维细胞、骨髓细胞及部分成骨细胞和骨细胞，因此弃之不用。剩余的骨片再用胰蛋白酶消化，无细胞释放，证实骨片中仅含有埋藏于基质中的骨细胞，而无其它细胞。骨片在培养液中浸泡后，静止骨细胞通过骨小管内细胞缝隙连接^［11］,感知外界溶液浓度变化,特别是钙离子浓度变化^［10］,开始活跃起来,通过骨细胞性溶骨作用^［12］释放出来,在骨片周围形成贴壁细胞,但一般要经过2周以上时间,且贴壁细胞仅出现于骨片周围^［10］,数量有限。在骨细胞释放出来以前,再次使用胰蛋白酶可大大加速其释放速度和数量,既代替了胶原酶的作用,又可避免成纤维细胞的混入。消化细胞接种后，经2～3周培养可达汇合,取第2、3代细胞检测，可避免长期培养，反复传代后引起细胞分化和表型的改变。本实验结果显示，此方法简单、实用，并可获得足够数量的成骨细胞。

二、成骨细胞与成纤维细胞的鉴别

骨组织消化后的上清液中，除成骨细胞外，不可避免的混有骨髓中的血细胞及成纤维细胞。血细胞为悬浮细胞，换液后即可去除。成纤维细胞与成骨细胞来源相同，同为贴壁细胞，且生长极迅速，很快取代成骨细胞。Wong和Cohn^［9］的研究证实，用胶原酶消化6次后，可<