第四军医大学学报1999年第20卷第5期

张蒙苏映军陈璧汤朝武

摘要 目的：研究内毒素及肿瘤坏死因子对肝细胞超微结构的影响.方法：我们采用胶原酶二步法灌注一月龄SD雄性大鼠肝脏，制备肝细胞悬液并进行了原代培养，重点研究了内毒素、肿瘤坏死因子对原代短期培养肝细胞超微结构的影响.结果：表现为糖原减少、溶酶体增多、线粒体肿大、嵴溶解、内质网扩张及断裂、甚至可见核空泡化、染色质消失. 其中以肿瘤坏死因子引起的肝细胞损伤为重;若二者联合作用，则肝细胞受损更加严重.结论：内毒素与肿瘤坏死因子均可使体外培养肝细胞超微结构受损.

关键词：内毒素肿瘤坏死因子肝细胞超微结构

引言

肝脏是肠道细菌移居中的重要脏器，其中肝细胞、枯否细胞对细菌移居的发生及发展起十分重要的作用. 为避免体内各种复杂因素的干扰，我们研究了内毒素、肿瘤坏死因子对原代培养肝细胞超微结构的影响，这有助于进一步阐明肠道细胞移居的机理.

1材料和方法

1.1材料上海产1月龄SD雄性大鼠，体重90 g～100 g. DMEM培养基（Gibco公司），0.3 g/L Ⅰ型胶原酶溶液50 mL(Sigma 公司, DMEM为溶剂)，磷酸缓冲液（PBS）250 mL， LPS（Sigma公司），TNF标准品（5万U/支, 北京军事医学科学院），RDB-TB蠕动泵（江苏省张家港市仪表仪器总厂），离心机，型号为Biofuge 15R( 德国Heraeus公司).

1.2方法1月龄SD雄性大鼠腹部消毒后按2 mL/kg，ip 10 g/L戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定. 脱去胸腹部毛，消毒，无菌操作下，开胸将导管插入下腔静脉胸段，丝线固定. 开腹显露门静脉，远离肝脏处结扎肝动脉、脾静脉、下腔静脉与肾静脉汇合处. 剪破门静脉近肝脏处，以9 mL/min速度灌注PBS 15 min， 以8 mL/min的速度灌注I型胶原酶10 min，收集肝包膜内细胞于DMEM中，依次经100，150，180，280，400目不锈钢滤网过滤后的细胞悬液于4℃，50 g离心2 min，弃上清，反复离心3次，沉积的细胞用含100 mL/L小牛血清DMEM调整细胞密度为2×10⁸个细胞/L，台盼兰拒染法测细胞活力90%^［1］. 以此细胞密度在6孔培养板中加入细胞悬液4×10⁵个细胞/孔. 36 h后换液并分别加入作用因素，试验共分4组，TNF组：50 MU/L TNF， 20 μL/孔；LPS组：0.1 g/L LPS， 20 μL/孔；TNF+LPS组：50 MU/L TNF, 20 μL/孔，0.1 g/L LPS， 20 μL/孔；并设对照组，每组设6个复孔，继续培养24 h后吸去培养孔中培养液，加入一定量的1.25 g/L胰蛋白酶于37℃下作用6 min，吸去胰蛋白酶，加入含100 mL/L小牛血清之DMEM，用吸管轻轻吹打培养皿底部，各组细胞分别收集于锥形离心管中，2 000 r/min速度离心10 min，底部沉积物加入30 g/L戊二醛固定，常规包埋，切片，染色，于透射电镜下观察，摄像.

2结果

内毒素与肿瘤坏死因子作用24 h后，均可使体外培养肝细胞超微结构受损，表现为糖原减少，溶酶体增多，线粒体肿大，嵴溶解，内质网扩张及断裂，甚至可见核空泡化，染色质消失，其中以肿瘤坏死因子引起的肝细胞损伤为重，若二者联合作用，则肝细胞受损更加严重（Fig 1～6）.

图 1LPS作用后肝细胞内质网、线粒体肿大

fig 1Swelling of mitochondria and endoplasmic reticulum in cultured hepatocytes induced by LPS×5 000

2LPS作用后肝细胞溶酶体增多、糖原减少

fig 2Increase of lysosome and decrease of glycogen in cultuled hepatocytes induced by LPS× 4 000

3TNF作用后肝细胞线粒体肿大，嵴溶解，空泡化，内质网高度扩张，糖原减少

fig 3Swelling of mitochondria and dissolution of their cristae, vacuolation, heavy expansion in cultured hepatocytes induced by TNF×5 000

4TNF作用后溶酶体增多，核变形，空泡化，线粒体嵴溶解

fig 4Increase of lysosome, nuclear degeneration and vacuolation, dissolution of mitochondria cristae in cultured hepatocytes induced by TNF×6 000

5LPS+TNF作用后肝细胞内质网断裂、核固缩变形、线粒体肿大、嵴溶解、糖原减少

fig 5Splitting of endoplasmic reticulum, swelling of mitochondria and dissolution of their cristae, decrease of glycogen, karyopyknosis in cultured hepatocytes induced by LPS and TNF× 4 000

6LPS+TNF作用后肝细胞糖原减少、溶酶体增多

fig 6Decrease of glycogen, increase of lysosome in cultured hepatocytes induced by LPS and TNF×5 000

3讨论

烧伤大鼠在内毒素注射后48 h～72 h，肝细胞严重变性坏死，其中灶性胞浆内溶解性坏死（FCN）多见，这些病变与烧伤条件下内毒素的直接作用和继发性损害有关，且彼此之间互有联系，炎性介质或其它生物活性介质的释放进一步促进了肝细胞损伤^［2］. 电镜下肝细胞可显示不同程度变性坏死，如肝细胞空泡化、线粒体肿胀、内质网扩张、糖原颗粒减少. 肝细胞摄取的内毒素主要分布于线粒体中，烧伤时肝细胞线粒体是内毒素在肝内降解的主要部位之一，内毒素所致肝细胞损害主要是通过内毒素血症，肝微循环障碍、肝细胞糖、蛋白质及脂肪代谢异常直接损害肝细胞超微结构促使肝内枯否细胞功能改变，毛细血管膜上Na⁺-K⁺-ATP酶活性改变等多种途径致伤. 内毒素血症可经C3旁路或经典途径激活补体，可直接或间接损害肝脏，内毒素通过肝细胞膜上LPS受体被肝细胞摄取，经溶酶体降解，其毒性部分类脂A被转运至线粒体内膜，抑制ATP合成酶和还原烟酰胺腺嘌呤而引起线粒体损伤；内毒素还可通过抑制磷酸烯醇式丙酮酸羟化酶活性干扰糖异生，通过增加丙酮酸激酶合成促进糖分解代谢进而造成糖原颗粒减少等肝细胞超微结构变化，近年来发现内毒素血症时枯否细胞功能增高，通过释放毒性物质如TNF，PAF引起肝细胞损伤，LPS还能激活补体，使血浆PGE和PGE₂增高，PAF，IL-1，IL-6，IL-8，TNF活性增加，其中TNF被认为是导致肝细胞坏死的主要因素.

我们的实验结果从细胞水平进一步证实LPS，TNF对肝细胞超微结构有损伤作用，且以TNF引起的损伤为重，若二者联合应用，损伤更重. 这说明LPS刺激枯否细胞释放的TNF在细胞损伤中占重要地位，且LPS与TNF具有协同作用，可加重肝细胞损伤.

基金项目:国家自然科学基金资助项目No. 39290700

作者简介:张蒙，男，1965-12-26生，安徽省界首市人，汉族. 1990第四军医大学毕业，1995年第四军医大学硕士，主治医师，讲师. 发表论文1篇. Tel:(029)3373478Fax:(029)3251734E-mailburns@fmmu.edu.cn

作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤外科, 陕西 西安 710033

参考文献

1 Berry MN, Friend DS. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells. A biochemical and fine structural study. J Cell Biol, 1969;43(3):506-520

2 刘友生，晏良遂. 烧伤复合内毒素血症对肝脏的损害及其意义的研究. 中华整形烧伤外科杂志， 1994;10(2):142-145