第四军医大学学报1999年第20卷第10期

张燕玲张国成许东亮

摘要目的： 探讨人细小病毒B19 (HPVB19)与增生性淋巴组织疾病的相关性.方法： 慢性淋巴结炎伴反应性增生42例， 恶性淋巴瘤29例， 结核性淋巴结炎15例. 采用巢式PCR技术扩增86例石蜡包埋活检淋巴结组织B19-DNA.结果： 检出B19 DNA 18例， 阳性率为20.9%， 其中慢性淋巴结炎检出15例， 阳性率35.7%； 恶性淋巴瘤检出3例， 阳性率为10.3%； 结核性淋巴结炎均为阴性.结论： HPVB19可能是引起慢性淋巴结炎伴反应性增生的重要病因之一. 在恶性淋巴瘤组织中发现HPVB19-DNA， 其与恶性淋巴瘤的关系值得进一步研究.

关键词：细小病毒B19，人淋巴结炎淋巴瘤聚合酶链反应

0引言

人细小病毒B19 (human parvovirus B19, HPVB19)是细小病毒家族成员之一， 亦是目前该病毒属中惟一能引起人类疾病的病毒. 现已知传染性红斑、 一过性再障危象、 胎儿水肿、 死胎、 关节病等^［1］， 均可由HPVB19引起. 随着对该病毒的深入研究， 其引起的疾病谱在不断扩大. 最近有报道HPVB19能引起淋巴结受累^［2］. 但国内尚未见有人对增生性淋巴结疾病中HPVB19感染进行较为系统的研究. 为了研究它们之间的相互关系及增生性淋巴结疾病可能存在的病因学， 我们采用巢式聚合酶链反应(PCR)对86例增生性淋巴结疾病进行了HPVB19-DNA检测研究.

1材料和方法

1.1材料共计86例， 均为1996～1997就诊于本校西京医院和乌鲁木齐军区总医院门诊或病房. 经局部手术切取的活体淋巴结组织， 检测前已经病理学确诊， 每例活检淋巴结组织均由石蜡包埋用作检测标本. 其中慢性淋巴结炎伴反应性增生42(男25， 女17)例， 平均年龄20.8 (1.25～46)岁； 淋巴瘤29(男19， 女10)例， 平均年龄36.6 (6～70)岁； 结核性淋巴结炎15(男8， 女7)例， 平均28.9 (7～51)岁. 除17例淋巴瘤标本来自乌鲁木齐军区总医院外， 其余均来自本校西京医院. 病毒质粒来源： HPVB19纯化质粒来自沙特皇家医院研究中心(KFSH Research Center), 提纯后含量为70 mg/L. 试剂引物： 按文献［3］方法合成， 第1对引物1S对应于HPVB19-DNA碱基位置为2 905～2 924, 2A对应于4 016～3 997, 循环后产物为1 112 bp, 引物碱基顺序为1S 5-CTTTAGGTATAGCCAACTGG-3; 2A 5-ACACTGAGTTTACTAGTGGC-3; 第2对引物3S对应于HPVB19-DNA碱基位置为3 187～3 206, 4A对应于3 290～3 271, 产物为104 bp, 引物碱基顺序为3S 5-CAAAAGCATGTGGAGTGAGG-3; 4A 5-CCTTATAATGGTGC-TCTGGG-3. Taq DNA聚合酶， 4×dNTPs, 10×PCR buffer, 琼脂糖， 蛋白酶K， PGEM Marker, Tris. PCR仪： 美国MJ Research公司产品.

1.2方法标本DNA提取： 石蜡包埋块切成10 μm厚组织片， 经正辛烷、 无水乙醇脱蜡脱脂(2次)， SDS与蛋白酶K裂解消化48 h～72 h, 95℃水浴中灭活， 之后用酚氯仿异戊醇抽提(2次)， 无水乙醇沉淀之后用750 mL/L乙醇冲洗沉淀片， 晾干后用pH 8.0 TE (10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA)溶解， -20℃保存待检. 巢式PCR扩增淋巴结疾病组织中HPVB19-DNA： 第1次扩增： 将50 μL PCR反应液逐一加样于Eppendorf管内， 管内含双蒸水35 μL， 10×buffer 5 μL, 4×dNTPs 1 μL, Taq DNA聚合酶1 U (1 μL), 引物1S 300 ng (1.5 μL), 2A 300 ng (1.5 μL), 模板5 μL(阳性对照5 μL， 阴性对照以双蒸水作模板). 混匀后用石蜡油35 μL覆盖. 95℃变性5 min, 之后在PCR仪中循环35 wk， 反应条件为： 93℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72℃ 1 min, 循环结束后72℃延伸10 min. 第2次扩增： 取第1次PCR循环产物5 μL为模板， 1S, 2A被3S， 4A代替， 同上述条件进行第2次PCR循环. 取第2次扩增产物10 μL点样于20 g/L含有溴化乙锭琼脂糖凝胶中电泳30 min, 紫外分析仪上观察， 在对应于104 bp位置处出现特异荧光条带者为阳性(Fig 1).

图1临床标本检测及两次扩增产物比较

Fig 1Clinical specimens detection and comparison of two amplification products

1: PGEM-3ZF-HaeⅢ marker; 2: Positive control; 7, 8: Positive specimen. 2nd time nested PCR amplification products; 9: Negative control; 3, 5, 6: Negative specimens; 4: 1st time nested PCR amplification products.

2结果

增生性淋巴组织疾病标本86例， 检出HPVB19-DNA阳性标本18例， 阳性率20.9%. 其中慢性淋巴结炎伴反应性增生检出B19-DNA 15例， 阳性率35.7%； 恶性淋巴瘤检出3例， 阳性率10.3%, 结核性淋巴结炎全部标本检测为阴性.

3讨论

1981年Pattsion等首先报道6例镰状细胞病患儿发生一过性再生障碍性贫血危象的病因是HPVB19感染所致后， 逐渐发现HPVB19能引起人类很多疾病. 1991年Meyer等^［2］第1次报道HPVB19感染所致组织坏死性淋巴结炎3例， 在这些患者血清中检出HPVB19特异性抗体IgM. 1997年Yufu等^［4］报道HPVB19感染噬血细胞综合征患者1例， 该患者颈部淋巴结肿大、 触痛， 淋巴结活检发现其组织中有变性的淋巴细胞， 还有大量组织细胞和片状坏死区， 其特征类似于组织坏死性淋巴结炎， 用免疫组化方法检测出HPVB19阳性细胞. 这进一步证实HPVB19感染可以引起淋巴结炎症. 在我们检测的86例淋巴结疾病组织标本中， HPVB19-DNA阳性率占20.9%. 说明HPVB19可以感染淋巴结.

在本研究中慢性淋巴结炎标本检出HPVB19-DNA 15例， 阳性率35.7%， 与恶性淋巴瘤(10.3%)和结核性淋巴结炎(0%)阳性率比较有显著性差异(P_R=0.0058), 这提示HPVB19可能是引起慢性淋巴结炎的一个重要病因之一. Fujita等^［5］报道1例霍奇金淋巴瘤患儿在病情缓解期感染HPVB19而导致红细胞再生不良和全血细胞减少. 尚未见有淋巴瘤组织中检测到HPVB19-DNA的报道. 本研究中有3例恶性淋巴瘤患者， 均为第1次淋巴结活检确诊为该病， 并未进行化疗或受到其它外来免疫抑制的作用， 其淋巴结组织标本HPVB19-DNA阳性. 这说明HPVB19可以感染恶性淋巴瘤组织， 但恶性淋巴瘤是由HPVB19感染引起， 还是因淋巴瘤发生后免疫功能下降而再感染HPVB19， 因缺乏当时的血清学及其它方面检查， 尚难确定. 这提示应注意HPVB19和肿瘤的关系， 并对此方面作进一步研究. 在恶性淋巴瘤HPVB19-DNA阳性标本中， 有1例来自乌鲁木齐军区总医院， 这是首次报道新疆地区存在HPVB19感染.

结核性淋巴结炎15例标本均未检出HPVB19-DNA， 其原因不详， 是否存在一种抑制B19病毒感染的反应系统， 值得扩大研究.

HPVB19感染途径较复杂， 其能通过患者分泌物或血液等方式传播^［6］. HPVB19进入人体后， 经血液和淋巴液到达淋巴结， 在局部生存、 繁殖， 引起淋巴结充血、 水肿、 坏死. 而Solininka等^［7］认为HPVB19感染可产生抗双倍线状DNA抗体和抗淋巴细胞自身抗体， 故认为参与自身免疫反应可能是其致病的机理. 迄今， 国内外尚未见HPVB19与增生性淋巴结疾病的关系进行较为系列的研究， 本研究在此方面只是一个初步的探讨， 有许多问题还有待深入研究.

作者简介：张燕玲， 女， 1961-12-17生， 河北籍， 汉族. 1984年新疆石河子医学院毕业， 主治医师， 96全军临床医学中青年人才培养基金班学员， 发表论文3篇. 导师张国成. 工作单位： 解放军23医院儿科新疆 乌鲁木齐 830006. 电话：(0991)4997483(H)

作者单位：第四军医大学西京医院小儿科，陕西 西安 710033)

参考文献

1 Stanley J, Naides MD. Parvovirus B19 infection. Rheum Dis Clin North Am, 1993;19(2):457-475

2 Meyer O, Kahn MF, Grossin M et al. Parvovirus B19 infection can induce histiocytic necrotizing lymphadenitis (Kikuchi's disease) associated with systemic lupus erythematosus. Lupus, 1991;1(1):37-41

3 Musiani M, Azzi A, Zerbini M et al. Nested polymerase chain reaction assay for the detection of B19 parvovirus DNA in human immunodeficency virus patients. J Med Virol, 1993;40(2):157-160

4 Yufu Y, Matsumoto M, Miyanura T et al. Parvovirus B19-associated haemophagocytic syndrome with lymphadenopathy resembling histiocyti necrotizing lymphadenitis (Kikuchi's disease). Br J Haematol, 1997;96(4):868-871

5 Fujita H, Takada K, Kuremoto K et al. Human parvovirus B19 infection in patients with hematologic disorders on chemotherapy. Rinsho Ketsuek, 1993;34(1):28-33

6 张国成. 儿童细小病毒B19感染. 国外医学儿科学分册， 1994；21(4)：257-260

7 Solininka CA, Anderson MJ, Laskin CA. Anti-DNA and antilymphocyte antibodies during acute in