【 摘要 】目的旨在分离人类疱疹病毒7型（HHV-7）的南京地方株。方法收集健康成人及肾病患儿唾液，经抗生素处理和离心过滤后接种于PHA预刺激的人脐带血单个核细胞 (CBMC), 当细胞出现气球样病变效应(CPE)时,透射电镜观察病毒颗粒、特异性引物扩增病毒核酸并对分离株的 PCR扩增产物作序列测定。结果从7例唾液标本中分离出4株病毒，电镜下呈典型疱疹病毒科病毒形态，经巢式PCR扩增都在预期的186bp（外引物）和92bp（代表株，内引物）处出现条带，代表株186bp产物序列与标准株RK和JI株基因相应区域同源性为100%。结论分离的病毒为HHV-7。

Isolation of human herpesvirus 7 from saliva samples: Identification by electron microscopy and molecular biology methods

REN Qiang, YAO Kun, PENG Guangyong, et al.

(Department of Microbiology, Nanjing Medical University,Nanjing 210029,P.R.China)

【 Abstract 】ObjectiveThe present research intends to isolate Nanjing local strains of human herpesvirus 7 (HHV-7).MethodsSaliva were sampled from health individuals and from children with kidney disease. After treatment with antibiotics and filtering, the samples were inoculated to the umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs) stimulated by phytohemagglutinin. When the infected cells presented the typical ballooning and polykaryotic cytopathic effects (CPE), transmission electron microscopy of cells was performed. DNA was extracted and polymerase chain reaction was carried out using the primers specific for HHV-7. The PCR products were also sequenced.ResultsFour strains were isolated from the seven saliva specimens. Electronic microscopy showed the presence of virus-like particles with the characteristic features of herpesviruses. The expected PCR product was amplified from both isolates. The specificity of the reaction was confirmed by DNA sequence and 186bp fragments revealed an identity with HHV-7 RK and JI of 100%.ConclusionThe isolated virus was HHV-7.

【 Subject words 】Human herpesvirus 7; Virus isolation; PCR; DNA sequence

人类疱疹病毒7型（human herpesvirus-7, HHV-7)是1990年由Frenkel等人首先从健康成人外周血单个核细胞(PBMC)中分离^〔1〕 , 主要侵犯CD4⁺ T淋巴细胞^〔1,2〕，与HHV-6、巨细胞病毒（HCMV）同属于β-疱疹病毒^〔2〕，免疫学、分子生物学分析证明它是又一新的亲淋巴细胞人类疱疹病毒^〔2〕。随后Hidaka^〔3〕、Wyatt^〔4〕、Black^〔5〕从唾液中分离出HHV-7并说明其与HHV-6一样普遍存在。尚无明确证据说明它可引起何种疾病，但一般认为它与婴幼儿急疹有一定的关系，并可激活潜伏感染的HHV-6^〔6〕。本文报道从健康成人及肾病患儿唾液中分离HHV-7南京地方株及其鉴定的结果。

材料和方法

标本来源：唾液取自本室2名健康人员，年龄均为28岁；南京市儿童医院住院肾病(包括肾病综合症,紫癜性肾炎等) 患儿5名，年龄3～5岁不等。

试剂：RPMI 1640（Gibco BRL），Ficoll-Hypague淋巴细胞分离液（中国医学科学院血液学研究所），HHV-7单克隆抗体KR-4（日本大阪大学医学部山西弘一教授惠赠），HHV-7特异性PCR引物（中国科学院上海细胞生物学研究所合成）。其它试剂：PHA（Sigma），IL-2（南京军事医学研究所），羊抗鼠IgG荧光抗体（上海华美生物制品公司），PCR套装试剂盒FDDK-2（上海复华公司）。

病毒及其传代细胞：HHV-7 Glasgow株及其传代细胞SUPT1，由香港大学微生物学系J.S.M.Peiris博士惠赠，SUPT1在含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中传代培养。HHV-6 GS株及其传代细胞HSB2，由香港大学微生物学系吴文翰教授惠赠，HSB2在含10 %新生牛血清的RPMI 1640培养液中传代培养。

人脐带血单个核细胞(CBMC)的制备：南京市妇产医院提供脐血，肝素抗凝，Ficoll淋巴细胞分离液常规方法分离，用含15%新生牛血清、PHA 10mg/L、IL-2 10⁴U/L的RPMI 1640培养液调整细胞数为2×10⁹/L，于37℃、5% CO₂环境生长48 h预激活。

病毒分离传代：取唾液3ml铺于平皿中，加5×10⁶U/L青霉素、5×10⁶μg/L链霉素各1.5ml，4℃过夜，2 000r/min离心20 min，上清经0.45μm滤膜过滤后，吸取1ml接种于上述已激活的CBMC中，适时换液，逐日观察细胞病变效应(CPE)。细胞出现CPE，收集细胞或上清继续在预激活的CBMC和SUPT1上传代。如未出现CPE则盲传3代，每代观察20 d后仍无CPE出现之标本，判为阴性。

电镜观察：当分离标本接种的CBMC出现明显CPE时，收集感染细胞、固定、行超薄切片、铅染后透射电镜观察。

间接免疫荧光染色：取CPE明显时的受感染SUPT1细胞，经PBS洗涤后制成10⁹/L细胞悬液涂片，常规方法行间接免疫荧光染色，一抗为HHV-7的单克隆抗体KR-4(1∶5)，二抗为荧光标记的羊抗鼠IgG (1∶25)，0.1%伊文斯蓝复染10 s，荧光显微镜观察。

PCR检测病毒DNA：取CPE明显时的受感染的CBMC，蛋白酶K消化，酚、氯仿、异戊醇常规方法抽提DNA。引物按Berneman^〔2〕的设计合成。 HV7：5′-TATCCCAGCTGTTTTCATATAGTAAC-3′(26mer)；HV8：5′-GCCTTGCGGTAGCACTAGATTTTTTG-3′(26mer)。循环体系为50μl反应体系，含缓冲液5μl、dNTP 5μl、模板5μl、引物各1μl，FD DNA多聚酶1μl，水32μl；循环条件：94℃预变性5 min后，按94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次，末次循环延伸时间延长为5 min。产物分析：2%琼脂糖电泳，UVP凝胶成像扫描系统观察。

对5号阳性标本的186bp产物的进一步扩增：以5号标本外循环186bp产物作为模板，引物按F.Wilborn^〔7〕的设计合成。 P3：5′-CATCCAGAAATGATAGACAG-3′(20mer)；P4：5′-AGGAGAATTCTGTACCCAT

G-3′(20mer)。循环体系：引物为内引物P3、P4，其余同外引物。反应条件：将退火温度增高为58℃，其余同外引物。

对5号标本186bp PCR产物的序列分析：纯化后双脱氧法测序。

结果

1．病毒分离及传代结果：5例肾病患儿唾液中有3例病毒分离阳性，定名为YY1、YY2、YY5，2例健康成人中1例阳性，定名为YY6。病毒在PHA预激活的CBMC中原代培养所致CPE为细胞变大变圆，透亮，呈气球样变，多个巨大细胞可融合成合胞体（见图1)。原代接种后8～14 d出现CPE，10～12 d达高峰，随着在预激活CBMC和SUPT1上传代的增加，CPE出现时间缩短为3～5 d，高峰时间缩短为5～7 d。SUPT1上出现CPE的特点类似CBMC。

图1分离病毒在CBMC上的CPE(200×)

Fig 1. The infected CBMCs presented the ballooning and polykaryotic CPE(200×)

2．电镜观察：在感染细胞浆中见有成熟疱疹病毒颗粒，圆形，直径约180nm，具包膜、被膜及有致密核心（见图2箭头A）。也可见仅有包膜、被膜但缺乏核心的病毒颗粒（见图2箭头B）。

3．间接免疫荧光染色结果：试验表明，4例分离病毒及阳性对照Glasgow感染的SUPT1细胞在荧光显微镜下均呈黄绿色荧光的阳性结果。

4．PCR对病毒DNA的检测结果：显示4例分离病毒及Glasgow株DNA提取物经PCR扩增后于186bp处出现预期条带，而 HHV-6 GS株感染的HSB2细胞和未感染病毒的CBMC的提取物不能扩增出此条带（见图3）。

5．以YY5为代表的内引物扩增结果：可在92bp处出现条带,与Glasgow一致（见图 4）。

6．YY5 186bp的PCR扩增产物序列如下：

5′-TATCCCAGCTGTTTTCATATAGTAACATTACCAATTCAGT-40

TTTCATCCAGAAATGATAGACAGATGTTGGTGTCAAGCTA-80

TCCTAATGAAGGCTACTTTGAAGTACAAATGTGCCCATGG-120

GTACAGAATTCTCCTCTTCAAATTGTTATTAAATCTTTTT-160

CAAAAAATCTAGTGCTACCGCAAGGC-186。

讨论

我们认为，从唾液中分离的病毒是HHV-7，理由如下：HHV-7普遍存在于唾液腺中，唾液中有很高分离率，且唾液是其主要传播途径，但唾液中几乎不能分离出HHV-6。这4株病毒均来自唾液，在PHA预激活的CBMC中出现典型气球样变，且出现时间(8～10 d)迟于HHV-6在CBMC中出现CPE的时间(3～5 d)。特异性的HHV-7单克隆抗体KR-4作间接免疫荧光染色，这4株病毒感染的SUPT1细胞均表达HHV-7特异性抗原，与阳性对照Glasgow抗原性一致。