【 摘要 】目的建立测定IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA和RT-竞争PCR方法，探讨体外诱生条件并作临床初步应用。方法用自行设计和制备的IFN-γ cDNA和IL-4 cDNA竞争模板，作RT-竞争PCR，对健康人经PMA和calcium ionophore(钙离子载体)诱导的PBMC、11例健康人和13例哮喘患者PBMC作IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA定量测定。结果在建立了准确的定量测定mRNA方法的基础上，确认在calcium ionophore 2.0μmol/L浓度时，用PMA 100ng/ml诱导6?h或PMA 80ng/ml诱导7?h，IFN-γ mRNA或IL-4 mRNA表达分别达最高水平，两种细胞因子mRNA在健康人PBMC中不表达，而在10/13例和11/13例哮喘患者中分别呈不同程度的表达，其中IL-4 mRNA表达水平高于IFN-γ mRNA。结论用自行设计和制备的竞争模板经RT-竞争PCR法可对细胞内IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA作较准确的定量测定，方法简便且敏感；健康人PBMC需经一定条件刺激方可表达两种细胞因子mRNA；多数哮喘患者PBMC不经刺激即可表达两种细胞因子mRNA,IL-4 mRNA表达水平高于IFN-γ mRNA，提示本法可用于研究细胞因子基因表达和哮喘等患者细胞因子变化动态。

A competitive RT-PCR method for quantitative determination of IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA and its application

ZHU Qinghui, ZHANG Hongxi, SUN Bixiong, et al.

(Immunology and Molecular Biology Laboratory of Respiratory Field, First Hospital of Shanghai Textile, 200060 Shanghai, P. R. China)

【 Abstract 】ObjectiveTo establish a competitive RT-PCR method for quantitative determination of IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA and explore the optimal inductive condition in vitro.MethodsIFN-γ mRNA and IL-4 mRNA in PBMC induced by PMA and calcium ionophore of a healthy volunteer (HV) and in unstimulated PBMC of 11 HVs and 13 asthma patients were determined quantitatively with the established competitive RT-PCR method using self-prepared internal standard as competitive templets.ResultsA simple, sensitive and accurate method for quantitatively determining cytokine mRNA has been established in the HV′s PBMC stimulated with calcium ionophore 2.0μmol/L, and PMA 100ng/ml harvested at 6?h or PMA 80ng/ml harvested at 7?h, expression of IFN-γ mRNA or IL-4 mRNA reached the highest level respectively. In the HV′s unstimulated PBMC, the expression of mRNA of the two cytokines could not be detected. In unstimulated PBMC from ten and eleven of the thirteen asthma patients, IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA were expressed in various level, the former was lower.ConclusionThe method was simple, sensitive and accurate, HV′s PBMC, only stimulated, expressed mRNA of the two cytokines, but unstimulated PBMC from most asthma patients expressed IFN-γ mRNA and IL-4 mRNA, the former was lower. The method could be applied in exploring cytokine gene expression and monitoring the change of cytokine mRNA in PBMC of patients.

【 Subject words 】Competitive templet; IFN-γ; IL-4; mRNA; RT-PCR

检测细胞因子最早使用生物学或免疫学测定法，这两类检测可反映某种细胞因子分泌、吸附、消耗和降解后的净含量^〔1〕，但不能为细胞因子产生过程中基因转录、翻译及翻译后调控机制提供必要的信息，也不能反映细胞或组织内细胞因子基因表达水平。分子生物学技术的应用为此类研究提供了较为理想的途径^〔2〕，其中RT-PCR方法尤其适合于极微量的标本或低水平表达的标本^〔3〕。细胞因子的基因表达过程中mRNA的合成远先于分泌的蛋白产物，对临床具有早期诊断参考价值。为此，我们以自行设计和制备的内标准品作为竞争模板，用RT-竞争PCR对IL-4和IFN-γ mRNA作为定量测定，用以研究健康人PBMC经诱导后两种细胞因子表达的动态，对比检测健康人和哮喘患者PBMC中的表达水平，探讨其临床意义，兹将结果报告如下。

材料和方法

受检样品：健康人11名，均为献血员，年龄30～50岁，平均41.2岁；临床确诊的哮喘患者13名，年龄35～55岁，平均44.9岁，男2例，女11例，平均哮喘史24.6年，轻度4例，中度4例，重度5例。采取严格的防止RNA酶污染的措施采集24份EDTA-Na₂抗凝血，分离单个核细胞，-80℃冻存。

试剂和仪器：PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)、calcium ionophore (钙离子载体，Sigma)、琼脂糖(FMC)，RPMI 1640培养液(GIBCO)，Taq DNA多聚酶、AMV逆转录酶和dNTP(Promega), RNasin(华美生物工程公司)，DEPC(SERVA)，RNA提取试剂盒(Boehringer Mannheim), DNA回收试剂盒(上海华顺公司), oligo-dT(中科院上海细胞生物学研究所合成)，淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，RNA/DNA calculator(Phamacia Biotech公司)，DNA扩增仪(minicyclet MJ-150 Reserch公司)，图像处理系统(SX-100 image system，上海四星生物技术有限公司)。引物1～6依据文献〔4〕的原理由计算机辅助设计，引物7、8按文献〔5〕，合成单位同oligo-dT。

IFN-γ：引物1(P1)5′-TTTTGGGTTCTCTTGGCTGT

T-3′，引物2(P2)5′-CTCCTTTTTCGCTTCCCTGT-3′，

引物3(P3)5′-CTCCTTTTTCGCTTCCCTGTGCCATC

ACTTGGATGAGTTC-3′。

IL-4：引物4(P4)5′-AATTGCCTCACATTGTCACT

-3′，引物5 (P5)5′-CTCTCATGATCGTCTTTAGCC-3′，

引物6(P6)5′-CTCTCATGATCGTCTTTAGCCTACTCT

GGTTGGCTTCCTTC-3′。

β-actin^〔5〕：引物7(P7)5′CGCGAGAAGGTGA

CCCAGATC-3′，引物8(P8)5′-ATCACGATGCCAGTGG

TACGG-3′。

方法(全部实验过程均严格防止RNA酶污染)

用于IFN-γ和IL-4 cDNA扩增的竞争模板的制备：取健康人按常规无菌分离外周血单个核细胞(PBMC，细胞浓度2×10⁶/ml)，分别加入2.0μmol/L的calcium ionophone和不同浓度的PMA，用RPMI 1640完全培养液置37℃、5% CO₂分别温育不同时间，以诱生IL-4 mRNA和IFN-γ mRNA,温育后离心，收集PBMC，用同一批提取液于同一天按试剂盒说明书提取总RNA，在RNA/DNA calculator上测定含量和纯度，取总RNA 1.5μg,oligo-dT(300pmol/μl)0.5μl,dNTP(2.5mmol/L)1μl,RNasin(40U/μl)0.5μl,AMV逆转录酶(9U/μl)0.5μl，5×AMV buffer 2μl,以DEPC水补足至10μl作RT(42℃ 30?min,95℃ 4?min,4℃5?min);PCR：取上述RT产物(cDNA)3μl,20pmol/μl的P1、P3(或P4、P6)各1μl，dNTP 2μl,Taq酶0.5μl(5U/μl)，DD-H₂O 12.5μl，95℃ 60?s,66℃40?s,72℃ 45?s循环28次，72℃ 5?min,扩增IFN-γ cDNA内标准品(或94℃ 45?s,55℃ 45?s,72℃ 45?s,循环30次，72℃ 5?min，扩增IL-4 cDNA内标准品)，产物经3%琼脂糖电泳，于紫外分析仪下切割目的条带，按试剂盒说明操作回收内标准品，测定含量，分别以P1和P2(或P4和P5)为引物复作PCR，确定内标准品的合适用量，分装后作为竞争模板-80℃冻存。

IFN-γ和IL-4 mRNA的定量测定：取测定样本，用同一批提取液于同一天提取PBMC总RNA，在RNA/DNA calculator上测定含量和纯度，A260nm/A280nm＞1.7者作甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，继取总RNA各1.5μg，按上述条件作RT，先取3μl cDNA用P7和P8扩增，测定每份样品的β-actin mRNA^〔6〕，继作IFN-γ和IL-4 mRNA定量测定，即在含P1和P2(或P4和P5)的PCR反应液中各加入3μl cDNA和已知浓度的相应竞争模板，按上述温度和时间扩增IFN-γ cDNA或IL-4 cDNA，竞争PCR产物经3%琼脂糖电泳，在SX-100 image system上摄像、以已知浓度的竞争模板定标作密度定量，推知相应mRNA的相对含量。

结果

1.方法可靠性的确认：提取总的RNA经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，见18s和28s rRNA两条清晰的条带。所有样品β-actin mRNA的RT-PCR产物吸光度一致，说明管家基因(housekeeping gene)的表达水平一致，所提取的总RNA可用于mRNA定量测定。用所建立的方法测定一名健康人PBMC经calcium ionophore 2.0μmol/L和PMA 80ng/ml诱导6?h后的总RNA中IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA量，分别为3.25ng和6.10ng(该计量单位系以相当于0.5μg总RNA中含IFN-γ mRNA或IL-4 mRNA的相应cDNA ng数表示)。实验结果提示本定量方法可靠。

2.健康人PBMC体外诱生IFN-γmRNA和IL-4 mRNA水平

(1) PMA浓度对IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA水平的影响：健康人PBMC未经诱导不表达IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA，经40、50、80、100、140ng/ml PMA和calcium ionophore 2.0μmol/L诱导7?h后，随PMA浓度增大，IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA的表达逐渐增加，当PMA浓度细胞因子的mRNA为100ng/ml或80ng/ml时，IFN-γ mRNA或IL-4 mRNA表达量最高，超过上述浓度时mRNA量虽分别有所下降，但仍保持较高的表<