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按常规方法免疫动物，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，置HAT培养基内培养。待细胞克隆团出现后，分散的单克隆细胞团放入96孔板培养液中，继续培养待细胞长满孔底，取培养上清进行阳性克隆的筛选。采用间接ELISA法和免疫印迹加免疫双扩散两步法进行阳性克隆筛选。首先采用RA36半纯品抗原包板的间接ELISA法筛选阳性克隆，连续3次均阳性者，再进一步应用免疫印迹加免疫双扩散法作确定筛选。RA36半纯品经SDS-PAGE分离，电转至硝酸纤维素膜上，分别与各株单抗作免疫印迹反应，同时以RA36半纯品为抗原与单抗作免疫双扩散，免疫印迹出现Mr为36×103显色带并且免疫双扩散出现单一清晰可见沉淀线者即可确定为RA36单克隆抗体阳性。经过两步法筛选得到3株RA36阳性细胞株，细胞株培养上清与兔抗鼠Ig血清作免疫双扩散试验，鉴定其中1株为IgG型。将106杂交瘤细胞接种于BABL/c小鼠腹腔制备腹水，应用硫酸铵沉淀法纯化腹水抗体。
由于RA36抗原尚无商品供应，制备高纯度的RA36又非常困难，故本实验把重点放在产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株的筛选而不是抗原的纯化。我们试用半纯化抗原经两步筛选法成功制备出了抗RA36的单克隆抗体，对进一步研究RA36在RA滑膜中的表达以及纯化RA36，为建立RA36抗体的ELISA检测方法奠定了基础。
(收稿日期：2000-03-14)
