【 摘要 】目的探讨自杀基因TK（thymidine kinase，胸苷激酶）与细胞因子FL（Flt-3 ligand，Flt-3配体）在同一细胞克隆中表达的特性，为肿瘤的基因治疗提供实验基础。 方法构建以IRES（内部核糖体进入位点）相连的TK与FL的真核表达质粒，脂质体法转入人乳腺癌细胞株MCF-7中。MTT法检测GCV(Ganciclovir，更昔洛韦)对MCF-7/TK-FL细胞的杀伤活性，电镜、光镜及FACS法检测凋亡情况。ELISA法及Western blot对该细胞克隆分泌的FL进行定量、定性分析并检测其对CD34⁺细胞的促增殖活性。 结果构建的pIRES-TK-FL真核表达质粒以脂质体法可成功转入MCF-7细胞中，MCF-7/TK-FL细胞可被GCV有效杀伤并存在凋亡情况，IC₅₀值为0.5μg/ml。该细胞分泌的FL有蛋白水平的表达，ELISA法测定FL分泌量为每4天10⁵个细胞中15.7ng/ml，它具有刺激CD34⁺细胞增殖的活性。 结论MCF-7/TK-FL细胞可同时表达TK与FL基因，在自杀基因瘤苗的基础上，其分泌的细胞因子FL具有生物活性，可作为进一步加强免疫细胞功能的手段。

Construction and characterization of TK/FL recombinant protein

WANG Xiao, LI Liang, FENG Kai, et al.

（Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, P. R. China）

【 Abstract 】ObjectiveTo determine the in vitro behavior of simultaneously expressed TK and FL in cells. MethodsA recombinant vector carrying herpes simplex virus thymidine kinase gene (TK), internal ribosome entry site (IRES) and Flt-3 ligand gene (FL) was constructed, and transfected into the MCF-7 tumor cells (MCF-7/TK-FL). FL in the supernatant was detected by ELISA. MTT was adopted to determine the sensitivity of MCF-7/TK-FL cells to GCV (ganciclovir). The apoptosis of cells was monitored using electro-microscope and flow cytometry. ResultsMCF-7/TK-FL cells expressed both TK and FL genes simultaneously. Dose-dependent cell killing by a transduction of the HSV-TK gene followed by GCV treatment was observed. Apoptosis was also obvious in the MCF-7/TK-FL cells-GCV system. The amount of FL secreted in culture supernatant of MCF-7/TK-FL cells was 15.7ng/ml from 10⁵ cells during 4 days, as determined by ELISA. The supernatant was able to stimulate proliferation of CD34⁺ cells from human cord blood. ConclusionMCF-7/TK-FL cells may be used as a experimental vaccine for tumor therapy, they are also valuable in producing large quantity of FL.

【 Subject words 】Suicide gene; Flt-3 ligand; Cytokine; Gene therapy

肿瘤的自杀基因疗法首创于1986年。因为采取先转染后治疗的途径，整个基因治疗较容易控制，所以该项措施的研究很快开展起来。目前在美国已批准数项以此方法治疗脑胶质瘤、卵巢癌等的临床方案^〔1〕。FL是酪氨酸激酶Flt-3/Flk-2受体的配基，它是最近发现的一种早期造血生长因子，它在外周血干细胞动员、体外树突状细胞的扩增、癌症的免疫治疗及造血细胞的体外培养中都发挥重要作用^〔2〕。最近有关FL在促树突状细胞增殖方面的研究较多^〔3〕。

本研究中，我们构建了pIRES-TK-FL真核表达质粒，以脂质体转染MCF-7细胞，获同时表达TK和FL的阳性克隆，它分泌的FL有刺激CD34⁺细胞增殖的作用。在TK自杀基因疗法中介入FL，可利用FL自身的抗癌作用和对某些免疫细胞的促增殖作用加强多元瘤苗的抗癌效果，是一种细胞因子基因疗法与其它手段相结合的综合治疗途径。

材料与方法

试剂与材料：质粒：pIRES-neo，tgCMV/HyTK，FL基因片段。细胞株：MCF-7。酶及抗体：NruⅠ、EcoRⅤ、T4连接酶、XbaⅠ、SmaⅠ、BstXⅠ、NotⅠ、BglⅡ、BamHⅠ（ TaKaRa BIOTECH），山羊抗人FL一抗（Santa Cruz），生物素化兔抗山羊二抗IgG、辣根酶标记链亲和素（中山试剂公司）。试剂盒：质粒DNA提取试剂盒（Promega USA），Lipofectin (GIBCO BRL)，Wizard Genomic DNA purification system(Promega USA)，随机引物标记试剂盒(Promega USA)，化学发光试剂盒（Chemilumine science）。

pIRES-TK-FL真核表达载体的构建：pIRES-neo质粒用NruⅠ与EcoRⅤ酶切消化完全后，回收4.6kb的大片段，加入T4连接酶使其自身环化（切去了CMV启动子）。环化的pIRES-neo用XbaⅠ、SmaⅠ切开（失去neo），回收的大片段（3.73kb）与EcoRⅤ、XbaⅠ双酶切产物FL片段（570bp）相连，形成pIRES-FL克隆质粒，转化DH5α感受态细菌，筛选阳性克隆，提取质粒DNA，用BstXⅠ酶切鉴定。pIRES-FL质粒用XbaⅠ、BamHⅠ双酶切成2531bp与1779bp两个片段，回收1779bp片段备用；pIRES-FL质粒再用XbaⅠ、NotⅠ双酶切，回收2509bp片段备用；TK基因是由tgCMV/HyTK用BglⅡ、NotⅠ双酶切切下的2900bp片段，将其与上述1779bp、2509bp两个片段用T4连接酶相连，转化DH5α感受态细菌，挑选阳性克隆，提取质粒酶切鉴定。

脂质体介导pIRES-TK-FL真核表达质粒转染MCF-7细胞：MCF-7细胞在含10%小牛血清的DMEM中常规培养，转染前一天换液，使细胞融合率达50%～80%。转染前换无血清培养基并冲洗2遍。取pIRES-TK-FL质粒DNA 4μl（0.5μg/μl）和脂质体10μl（1μg/μl），分别加到96μl和90μl无血清培养基中，混匀，室温放置45min。随后将两者合并，迅速混匀，室温放置15min后，加入2ml无血清培养基，混匀后吸入培养瓶，覆盖全部细胞表面，置37℃ 5%CO₂培养箱进行转染，12h后换含10%小牛血清的DMEM继续培养，48h后传代并加潮霉素800μg/ml加压筛选，10～20d筛选出阳性克隆MCF-7/TK-FL细胞。HyTK及FL基因转染MCF-7细胞的方法同前，细胞克隆分别命名为MCF-7/TK及MCF-7/FL。

MCF-7/TK-FL基因组DNA的Southern blot鉴定：Wizard Genomic DNA purification system 常规提取MCF-7/TK-FL中的基因组DNA。按《分子克隆》的方法，将基因组DNA用EcoRⅠ酶切过夜，于4℃缓慢电泳，然后采用毛细管转移法将凝胶上DNA转移至硝酸纤维素膜上。转膜结束后，80℃干烤至膜干燥。68℃进行预杂交（6×SSC，5×Denharts，0.5% SDS，变性鲑鱼精DNA）3～4h，然后加入探针杂交24h，充分洗膜后进行放射自显影。MCF-7/TK细胞及MCF-7/FL细胞基因组DNA的Southern blot鉴定方法同上。

MTT法检测GCV对MCF-7/TK-FL的杀伤作用：将细胞分成A、B、C、D四组，A组为未转基因的MCF-7细胞；B组为MCF-7/TK细胞；C组为MCF-7/FL细胞；D组为MCF-7/TK-FL细胞。检测前使细胞融合率达70%～80%，将细胞稀释成2×10⁴/ml，在96孔板中每孔加入180μl，同时加入不同浓度GCV(Ganciclovir, 更昔洛韦) 20μl，使终浓度为10^-4～10⁴μg/ml之间，每实验组3个复孔，同时设置对照孔及调零孔。68h后加入MTT 20μl（5mg/ml），4h后弃上清加入DMSO溶解，10min后振荡，上酶标仪以490nm测吸光度(A)值，按下列公式计算细胞生长抑制率：

FACS法及电镜分析检测MCF-7/TK-FL/GCV系统中的凋亡现象：将MCF-7细胞、MCF-7/TK细胞、MCF-7/FL细胞及MCF-7/TK-FL细胞均分成A、B 2组。A组不加GCV；B组加GCV 0.5μg/ml。细胞以3×10⁴/孔接种于6孔板，GCV作用4d后以FACS法进行凋亡检测。上述处理的细胞经固定染色后在电镜下观察摄片。

Western blot法定性检测FL蛋白：MCF-7/TK-FL细胞上清蛋白质进行SDS-PAGE，电泳至染料抵达分离胶底部时，取下凝胶进行转膜。采用电转移法电转膜2h。转膜结束后进行封闭，然后在膜中加入溶有山羊抗人FL一抗的新鲜配制的封闭液，4℃轻轻振荡2h；用PBS漂洗除去过量的一抗；然后在膜上加入溶有兔抗山羊二抗的封闭液，室温振荡1～2h。取出滤膜，大量漂洗液洗3～5次，用德国宝灵曼的Chemilumine science发光试剂盒检测结果。

ELISA法定量测定FL蛋白：在96孔酶标板中，以包被液稀释标准品和上清样品,标准品包被梯度为40ng、20ng、10ng、5ng，待测样品为1/2上清原液，每种浓度设3个复孔。4℃过夜后弃去包被液，每孔加入200μl封闭液（0.01%Tween-20、20%小牛血清）37℃ 2h；弃去封闭液后加入山羊抗人FL一抗100μl共育37℃ 1h，然后用PBS洗2次；加入生物素化的兔抗山羊二抗100μl，37℃作用1h后再用含0.1%Tween-20的PBS洗2次；加入辣根酶链亲和素100μl，37℃作用1h后洗3次；加入OPD显色，有颜色变化即加入终止液，上酶标仪以490nm测定A值，绘制标准曲线，计算样品中的FL含量。

MCF-7/TK-FL细胞培养上清刺激人CD34⁺细胞增殖实验：在96孔板中加入5×10³/孔由免疫磁珠分离纯化的CD34⁺细胞，每实验组3复孔，培养液为体积分数12.5%马血清、12.5%胎牛血清、5×10^-7mol/L的氢化可的松的IMDM，加入所需的细胞因子，于37℃ 5%CO₂条件下培养10d后计数。细胞因子每48h添加1次，按细胞因子的不同组合设置7个实验组：① 不加任何细胞因子； ② GM-CSF 40ng/ml； ③ GM-CSF 40ng/ml+标准品FL； ④ GM-CSF 40