【 摘要 】目的将我国登革2型病毒的prM（D2-prM）基因导入甲病毒载 体（pSfV），研究该基因及其编码蛋白介导的抗病毒作用。 方法 首先将扩增的病毒prM基因导入pSfV的Sp6启动子下游并进行核苷酸序列测定。用SpeⅠ酶将p SfⅤ-prM重组DNA线形化，再将其体外转录成5′末端含帽子结构的重组RNA。然后通过电穿 孔法将此重组RNA转染BHK-21/13细胞。采用X-Gal原位染色和免疫荧光法对转染细胞的表 达产物进行分析。 结果通过碱基序列测定证明病毒的prM基因已 插入到甲病毒载体中，而且其重组DNA的转录物经RNaseA消化证实为RNA。重组RNA的细胞转 染率达90%以上。prM蛋白表达细胞约占80%。 结论由pSfV-prM R NA转染哺乳动物细胞所产生的蛋白可与登革2型病毒多克隆抗体起特异反应，证明体外转录 的重组RNA含有登革2型病毒特异序列。

Construction of the recombinant RNA of Chinese Dengue 2 virus prM gene-alphavir us vector

YU Man, QIN Ede, OU Wu, et al.

（Department of Virolog y, Institute of Microbiology and Epidemiology, AMMS, Beijing 100850, P.R.China）

【 Abstract 】ObjectiveThe aim of this study is to insert the premembrane (prM) gene of the Chinese Dengue 2 virus into the alphavirus vecto r (pSfV) and to investigate the prM gene-and its encoding protein-mediated res istance to Dengue virus. MethodsThe amplified prM gene w as cloned into the Sp6 promoter downstream of pSfV vector and its nucleotide seq uence was determined. The recombinant plasmid DNA was linearized by the enzyme S pe I digestion and transcribed in vitro into recombinant RNA which contained the capping analog on its 5′-end. Then the BHK-21/13 cells in vitro was transfected with synthesized RNA by electroporation. Analysis of the expressed p roducts in transfected cells was performed with in situ X-Gal staining and immu nofluorescence technique. ResultsThe nucleotide sequence assay of the fragment inserted in the recombinant plasmid DNA indicated that th e viral prM gene had been cloned into the alphavirus vector. Assay with RNase A digestion showed that in vitro the synthesized transcripts from the recombin ant pSfV-prM DNA was RNA. Transfection efficiency of the pSfV-prM RNA was grea ter than 90% and the number of positive cells expressing prM protein was 80%. [ WT5”HZ〗ConclusionThe expressed protein in mammalian cells transfe cted with the recombinant pSfV-prM RNA can react with polyclonal antibody again st Dengue 2 virus, indicating that the in vitro-transcribed recombinant RNA contains specific nucleotide sequence of Chinese Dengue 2 virus strain.

【 Subject words 】Dengue 2 virus; prM gene; Alphavirus vector; Recombinant RNA

据报道，全世界每年约有1亿登革热和25万登革出血热患者^〔1〕。但目前对这类蚊媒 病毒病仍无有效的防治措施。登革疫苗的研究已有50年的历史，至今尚未取得大的进展 ^〔2，3〕。近年来的研究表明，通过病毒载体释放特异基因来介导抗病毒作用的途径，可 避免由采用基因表达蛋白进行疫苗研究所出现的许多问题。尤其是新近研制成功的由Semlik i森林病毒(Semliki forest virus) 改构而成的虫媒甲病毒载体系统（pSfV），其宿主细胞 谱广、转录和释放外源基因的效率高。并且，用此载体构建的重组病毒颗粒或其重组RNA均 可直接作为免疫原，以病毒自然感染的方式提呈抗原，使宿主产生很强的B细胞和T细胞免疫 应答^〔4，5〕。

登革病毒的prM蛋白是病毒编码的三种结构蛋白中的一种糖蛋白，在病毒复制的晚期进 一步被宿主细胞的蛋白酶裂解去除N端的Pre区变成非糖基化的膜蛋白（M）而参与病毒的组 成^〔6〕。prM蛋白有多种抗原表位。Pre区具有与抗病毒免疫有关的抗原结构功能区 ，C端为疏水的跨膜结构区，易与宿主的细胞结合，是一种良好的结合性抗原。在4个型的登 革病毒中prM基因的核苷酸序列同源性很高。本研究将我国登革2型病毒43（D2-43）株的pr M基因导入甲病毒载体系统，研究该基因及其编码蛋白介导的抗病毒作用。

材料与方法

毒株和抗体：D2-43株病毒由本室从广西登革出血热患者血清中分离。该毒株的鼠免 疫腹水抗体由本室制备。羊抗鼠IgG荧光抗体为北京挚诚生物工程研究所产品。

甲病毒载体和宿主细胞株：甲病毒载体pSfV为GIBCO/BRL产品。BHK-21/13细胞株由 本所细胞库提供，该细胞于含5%小牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，10mmol/L Hepes，10% trypt ose phosphate broth和1%青、链霉素的DMEM培养基中，置37℃培养至单层。

全长prM基因的PCR扩增：根据D2-43株的prM基因序列设计上、下游引物。上 游引物（病毒基因组的400～421nts）：5′-GATC GGATCCGCAGGCGTGATTATTATGTTGA-3′； 下游引物（945～966nts）：5′-GATC GGATTCGTCTCTATTTGATATTCCTATG-3′（划线处为所加的碱基及BamHⅠ 酶切位点）。以我国D2-43病毒株的RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增全长的prM基因。PCR 扩增条件为：94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min扩增25个循环，最后于72℃延伸7 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后置-20℃备用。

pSfV-prM重组RNA的构建及鉴定

1.重组质粒DNA的构建：将扩增的prM基因首先插入pBluescript SK⁺ T载体中，再用BamH Ⅰ酶从T载体上切下prM基因片段，经琼脂糖电泳回收纯化，然后将该片段克隆到pSfV载体的 Sp6启动子下游的BamHⅠ位点。pSfV-prM重组质粒的构建见图1。

2.prM基因插入方向的判定：为了确定prM基因插入到病毒载体中的方向，首先根据pSfV载 体中多克隆位点上游的序列设计一条测序引物：5′-TGCGTTAATACACAGAATTCTGA-3′。重 组DNA中插入片段的核苷酸序列，用ABI PRISM^TM 377 DNA sequencer仪，由上海生工 生物工程公司进行测定。

3.重组RNA的制备：4种NTP，帽子结构类似物m⁷G （5′）ppp（5′）G和Sp6 RNA聚合酶 均为GIBCO/BRL公司产品。重组pSfV-prM质粒DNA用SpeⅠ酶于37℃消化1h，使之线形化后 ，加入酚/氯仿进行纯化。体外转录反应，含4种混合的10mmol/L的NTP，10mmol/L m⁷G（5 ′）ppp（5′）G帽子结构类似物，10mmol/L DTT，50U RNA酶抑制剂，1.5μg的线性化重 组DNA和38U的Sp6 RNA聚合酶，总体积50μl。

图1pSfV -prM重组DNA质粒的构建

Fig 1. Construction of a recombiant pSfV-prM plasmid

Sp6: The bacteriophage Sp6 promoter; nsp1-4：Nonstructural protein encoding g enes of Semliki forest virus; LacZ: β-galactosidase encoding gene

于37℃反应2h。RNA转录物可用RNaseA消化加以鉴定。

重组RNA的转染与表达：采用Bio-Rad公司的Gene PulserⅡ型电穿孔仪，将体 外转录的重组RNA转染BHK-21/13细胞。转染条件为：2×10⁷BHK-21/13细胞，6μg重组R NA，850V，25μF，300Ω，脉冲2次。将转染重组RNA的细胞接种于35cm²细胞瓶中，置37 ℃培养。于转染后30min和2h分别向培养基中加入100mmol/L KCl，然后继续培养至24、 48和72h并分别收取细胞进行检测。

表达产物的检测：

1.原位染色法：收取转染后24h的细胞，先用含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的PBS洗单层细 胞1次。加入1ml固定液（2%甲醛-0.05%戊二醛），室温放置5min，弃去固定液，再用PB S洗2次。加入X-Gal染液(1mg/ml X-Gal、5mmol/L的铁氰酸钾和亚铁氰酸钾、2mmol/L MgC l₂)，于37℃作用2h，弃去染液，用PBS洗细胞2次。于倒置显微镜下观察，阳性转染细 胞为蓝色。

2.免疫荧光法：分别将转染后24、48和72h收获的细胞配成50万/ml的细胞悬液，滴到已 处理好的抗原玻片孔内，50μl/孔，置37℃湿盒内5h使细胞贴壁。取出玻片于PBS液中漂 洗，室温晾干。然后置冷丙酮中于-20℃固定30min，取出玻片晾干。再按常规方法用D2- 43病毒株免疫的鼠腹水抗体为第一抗体进行间接免疫荧光染色，观察病毒蛋白抗原的表达。

结果与讨论

1.扩增的全长prM基因的鉴定：以D2-43病毒株的RNA为模板，采用RT -PCR方法扩增的prM基因片段，两端各含有1个BamHⅠ酶位点。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电 泳与标准分子质量比较，其大小约为560bp，与预期的相一致。将该片段纯化后克隆到T载体 中，用M13通用引物进行核苷酸序列测定，结果证实扩增的片段是登革病毒的prM基因序列， 与本实验室已发表的是一致的^〔7〕。

2.pSfV-prM重组RNA的构建与鉴定：将用BamHⅠ酶从T载体上切下的pr M基因插入甲病毒载体pSfV的