【 摘要 】目的构建登革2型病毒E基因的真核表达载体，实现登革病毒E蛋白的真核表达。 方法采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增登革2型病毒（NGC株）包膜糖蛋白E基因全长片段，克隆入真核表达载体pcDNA3的Pcmv启动子下游，构建重组真核表达质粒pcDNA3-E，用脂质体转染法转染NIH3T3细胞，表达产物以免疫荧光、SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析检测。 结果成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-E，通过脂质体转染法导入NIH3T3细胞，免疫荧光、SDS-PAGE和蛋白质印迹分析检测表明，E基因在NIH3T3细胞实现了真核表达，产物相对分子质量(M_r)为60×10³。 结论登革病毒E基因真核表达载体的构建及E基因的真核表达为研究登革病毒E蛋白的结构与功能、研制登革病毒诊断试剂及核酸疫苗奠定了基础。

The expression of E gene region of Dengue 2 virus in NIH3T3 and its identification

HONG Bangxing, JIANG Lifang, ZHANG Xin, et al.

（Department of Microbiology, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060, P. R. China）

【 Abstract 】ObjectiveConstruction of an eukaryotic expression plasmid of E gene fragment from Dengue 2 virus and eukaryotic expression of E glycosylated protein. MethodsThe E gene fragment of Dengue 2 virus NGC strain was amplified by RT-PCR and this fragment was cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3. The recombinant plasmid pcDNA3-E was thus constructed and identified by sequencing and digestion with restriction enzymes. The recombinant plasmid pcDNA3-E was transfected into NIH3T3 cell by lipofectin. The expressed protein was analyzed by immunofluorescence, SDS-PAGE and Western blotting assay. ResultsA recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3-E was successfully constructed. The recombinant plasmid expressed a 60×10³ protein of Dengue 2 virus. ConclusionsThe constructions of eukaryotic expression of E gene fragment from Dengue 2 virus and eukaryotic expression of E glycosylated protein will be helpful to study the structure and functions of the E protein, and to the development of Dengue diagnostic agents as well as Dengue virus nucleic acid vaccine.

【 Subject words 】Dengue virus; E gene; Vector; Eukaryotic expression

登革病毒E基因编码登革病毒最大的结构蛋白——包膜糖蛋白E，相对分子质量(M_r)为(51～60)×10³，E蛋白在登革病毒的致病机理(ADE作用^〔1〕)及诱发机体的抗感染免疫中发挥重要的作用。于曼、秦鄂德等^〔2〕对我国登革2型病毒43株E蛋白的原核表达做了研究。Sugrue等^〔3〕在酵母表达系统中表达了不同长度的登革1型病毒E蛋白片段。由于E蛋白是糖蛋白，原核表达对E蛋白的免疫原性及活性有一定程度的影响。本研究将登革2型病毒(NGC株)E基因导入真核表达载体pcDNA3，构建了真核表达质粒pcDNA3-E，并实现了E蛋白在NIH3T3细胞中的表达。

材料和方法

工程菌和载体：大肠杆菌E.coli DH5α，真核表达载体pcDNA3(5.4kb，含Pcmv和T₇噬菌体启动子)由本室保存。

病毒和细胞：登革2型病毒NGC株、白纹伊蚊C6/36细胞和小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞由本室冻存。

试剂：AMV逆转录酶、Taq酶和其它工具酶购自Promega公司；化学试剂均为国产分析纯；登革2型病毒小鼠多克隆腹水、兔抗登革2型病毒多克隆抗体由本室郭辉玉教授提供；FITC-羊抗鼠IgG购自军事医学科学院微生物流行病研究所；HRP-羊抗兔IgG为Sigma公司产品。

引物的设计与合成：根据登革2型病毒基因序列^〔4〕和PCR引物设计原则，设计并合成2条引物：E上游：5′GC GGTACC CA ATG ACA ATG CG3′(含KpnⅠ识别序列GGTACC和ATG起始密码)；E下游：5′GC TCTAGA ACT TTA GGC CTG CAC CAT AAC3′(含XbaⅠ识别序列TCTAGA和TAA终止密码)。

登革2型病毒全长E基因的RT-PCR扩增：以10^-2病毒滴度感染24h前新鲜传代的C6/36细胞，当细胞病变达+++～++++时收获3ml病毒培养上清，用异硫氰酸胍沉淀法^〔5〕提取其核酸作为逆转录模板，逆转录反应应用Promega公司的逆转录试剂盒(方法详见说明书)。PCR反应条件为94℃ 30s, 55℃ 40s, 72℃ 90s, 25个循环后，72℃延伸10min。

重组表达质粒的构建：用限制性内切酶KpnⅠ/XbaⅠ消化PCR纯化产物，从琼脂糖凝胶中以挖块回收法^〔6〕回收E基因酶切产物，与经KpnⅠ/XbaⅠ酶切的线性质粒pcDNA3连接，转化大肠杆菌E. coli DH5α，阳性重组子的筛选、酶切鉴定均按文献〔7〕操作。

核苷酸序列测定：小量提取的重组质粒pcDNA3-E经碱变性后，直接用T₇ promoter引物和SP₆ promoter引物对E基因片段的5′端和3′端进行序列测定，采用双脱氧末端终止法，用α-³²P-dATP标记。

转染质粒及转染细胞的准备：取大量提取的重组质粒pcDNA3-E溶于灭菌双蒸水100μl，用Tris*Cl饱和酚、氯仿/异戊醇(24∶1)抽提后经3mol/L NaAc(pH5.2)和无水乙醇沉淀，真空抽干，备用。NIH3T3细胞用含1%谷氨酰胺、0.45% NaHCO₃ 和10%胎牛血清的DMEM培养液培养于35mm的培养皿中，37℃培养24h至细胞密度达50%～80%的融合。

细胞转染：取重组质粒2μg溶于100μl无血清DMEM液，10μl脂质体稀释于90μl无血清DMEM液。将上述两液轻轻混合，室温放置25min。弃去细胞培养皿中的培养液，将上述混合液滴加至细胞表面，37℃孵育12h。弃去转染液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃培养3d后，更换含600μg/ml G418的DMEM培养液筛选，3d后将G418浓度降至250μg/ml以维持筛选作用，直至转染细胞克隆的形成,并对克隆细胞株进行扩增培养。

免疫荧光抗体法检测表达蛋白：将扩增培养的克隆细胞转入(35×10)mm的细胞培养皿，待细胞长满后用PBS洗3次，用丙酮固定3min，PBS洗3次，依次滴加登革2型病毒小鼠多克隆腹水(效价1∶300)及FITC-羊抗鼠IgG(效价1∶1000)，分别于37℃孵育30min并且用PBS洗去未结合的抗体，用免疫荧光显微镜观察照相。

SDS-PAGE检测表达蛋白：分别取适量扩增培养的克隆细胞及未转染的NIH3T3细胞，用冰预冷的细胞裂解液裂解后离心取沉淀，加入等量2×SDS加样缓冲液［100mmol/L Tris*Cl(pH8.0)，10% 2-巯基乙醇，4% SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油］，煮沸5min，加样进行SDS-PAGE，分离胶浓度为12%(pH8.8)，用含0.25%考马斯亮蓝R-250的甲醇-乙酸溶液(10%乙酸，50%甲醇，40%水)染色4h，甲醇-乙酸溶液脱色，观察结果并照相保存。

蛋白质印迹试验(Western blotting)：经SDS-PAGE分离细胞蛋白，电转移(0.19A，40V，4h)至硝酸纤维膜上，用封闭液(1%去脂奶粉，0.01% antifoam A，0.02%叠氮钠，溶于PBS中)室温封闭2h，以兔抗登革2型病毒多克隆抗体为第一抗体，HRP-羊抗兔IgG为第二抗体，分别在室温作用2h，用DAB显色。

结果

1.PCR扩增产物的鉴定：取PCR产物在1%琼脂糖凝胶上以λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ为相对分子质量(M_r)标准进行电泳，结果扩增出约1.5kb的片段(图1)

图1登革病毒2型(NGC株)E基因片段的RT-PCR扩增

Fig 1. The results of RT-PCR for E gene fragment of DV2

M: λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ; 1: E gene fragment of DV2 by RT-PCR

2.重组表达质粒的构建和酶切鉴定：目的基因和载体片段经酶切、连接、转化大肠杆菌E.coli DH5α后，挑取白色菌落，小量提取质粒。各取1μg提取的质粒，分别用BamHⅠ/XbaⅠ双酶切及BamHⅠ单酶切2h，1%琼脂糖凝胶电泳分析提取的质粒及酶切产物。重组质粒pcDNA3-E经BamHⅠ/XbaⅠ双酶切得到3个片段：220bp，507bp和6315bp；经BamHⅠ单酶切得到2个片段：507bp和6365bp(图2)。

图2pcDNA3-E重组质粒的酶切鉴定

Fig 2. The identification of pcDNA3-E recombinant by digesting using restriction enzymes

M1: λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ; M2: pBR322DNA/MSPI; 1: pcDNA3; 2: pcDNA3-E; 3: pcDNA3-E digested by BamHⅠ/XbaⅠ; 4: pcDNA3-E digested by BamHⅠ

3.核苷酸序列测定结果：测序反应使用Phamacia公司测序仪，8%聚丙烯酰胺凝胶(含40%尿素)电泳，放射自显影结果显示，pcDNA3-E重组质粒上E基因片段的5′端和3′端序列与已发表的登革2型病毒(NGC株)基因序列一致。

4.重组表