【 摘要 】目的观测位于HPV16 LCR序列YY1结合位点上游的组织特异性增强子序列对YY1蛋白的启动子P97抑制作用的影响。 方法构建带有不同长度的HPV16野生株、启动子远端YY1位点突变株、启动子近端YY1位点突变株的5′端LCR缺损序列的荧光素酶报导质粒，以及不同长度的近端YY1/SP1重叠结合位点基因工程突变LCR的荧光素酶报导质粒；将各种质粒转染到人类子宫颈癌细胞系C33A中，检测在不同LCR序列的控制下对病毒启动子P97的活性的影响。 结果去除上游增强子序列后，远端YY1位点突变的P97激活作用完全消失，近端YY1位点突变的P97激活作用部分丧失。不同长度的近端YY1/SP1重叠位点基因工程突变LCR对P97活性的影响不受上游启动子序列的控制。 结论YY1蛋白对启动子P97的抑制效应受位于其上游序列的增强子的控制。

YY1′s repression effect on HPV16 promoter P97 depends on the upstream enhancer sequences

DONG Xiaoping, LIU Hong, ZHOU Wei, et al.

（Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine,

Beijing 100052 ,P.R.China）

【 Abstract 】ObjectiveObservation of the possible effect of the upstream enhancer sequences on the YY1′s repression activity on HPV 16 promoter P97. MethodsDifferent 5′-deletions of LCR containing HPV 16 wild-type, promoter-distal YY1 binding site mutant and promoter-proximal YY1 binding site mutant sequences were generated in a luciferase reporter plasmid respectively. Meanwhile, 5′-deletions of LCR which contain a genetic engineering nucleotides exchange within the overlapping YY1/SP1 binding domain were also constructed. Different plasmid DNAs were transfected into a cervical carcinoma cell line C33A and the influences on P97 activity were evaluated by measuring expressions of luciferase. ResultsWith removing the enhancer sequences, the activating effect on P97 by the distal-site mutant was totally silent, while that by proximal-site mutant was partially reduced. The mutants involved in the overlapping YY1/SP1 site showed little effect on P97, regardless of the length of LCR. ConclusionYY1′s repression effects on P97 through bridging these two binding sites depend on the intact upstream enhancer.

【 Subject words 】Human papillomavirus; YY1 protein; Enhancer

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）16型的长控制区（long control region，LCR）为病毒基因转录的重要调节区域。在LCR中部有一组织特异性增强子区域，可在上皮细胞内增强病毒早期启动子P97的活性。增强子是由许多转录激活因子的特异性结合位点组成，其中包括有AP1、NF1、Oct1、TEFⅠ等^〔1〕。细胞转录调节蛋白YY1广泛存在于上皮细胞胞核内^〔2〕，对P97的活性起负性调节作用^〔3-5〕。YY1蛋白可通过多种方式对不同的启动子活性进行正相或负相调节，其机理包括与其它活性蛋白发生蛋白-蛋白间相互作用^〔6〕，与其它活性蛋白竞争性结合相应的结合位点^〔7〕，通过蛋白与DNA结合引起DNA空间结构的改变^〔8〕以及与其它非DNA结合活性蛋白作用后使后者作用于转录起始部位^〔9〕。

在HPV16 LCR序列上存在有多个YY1特异性结合位点，分布于增强子和启动子P97之间。由于增强子是由多个转录激活因子结合位点构成，因而有可能会参与YY1蛋白对P97的活性抑制作用。我们构建了不同的HPV16标准序列、启动子远端YY1位点和近端位点突变的5′端缺损LCR荧光素酶报道质粒，经转染细胞检测发现，在除去增强子后YY1结合位点突变引起的启动子活性增强效应明显减弱或消失。这表明YY1蛋白对P97的调节作用有赖于上游的增强子序列。

材料与方法

质粒构建：所有构建的检测质粒均以pAluc^〔3〕为基本骨架，插入序列均经DNA序列测定证实。质粒pH16-7004，pPM-D-7004和pPM-P-7004的构建如前文所叙述^〔3,4〕。pH16-7463，pPM-D-7463和pPM-P-7463构建如下：以SphⅠ分别水解克隆在pBS M13⁺的HPV原毒株LCR序列（pBS-H16）^〔3,4〕，启动子远端YY1蛋白结合位点点突变的HPV16 LCR序列（pT-390）^〔4〕，启动子近端YY1结合位点点突变LCR序列（pT-432）^〔3〕，除去HPV16 nt 7004～7462间的LCR序列，自身环化连接；以HindⅢ+BamHⅠ分别游离克隆的LCR序列（nt 7463～123），回收后分别连接至pAluc的相应位点构成质粒pH16-7463，pPM-D-7463和pPM-P-7463。

质粒pH16-7612，pPM-D-7612和pPM-P-7612构建如下：分别以质粒pH16-7004，pPM-D-7004和pPM-P-7004为模板，H16-7612（5′-CTGCACTATGTGCAACTA-3′）和H16-123^〔3,4〕为引物进行PCR扩增；扩增产物经T4多聚核苷酸激酶以及DNA聚合酶Ⅰ大片段作用后，平端连接至pSP6-64载体上；分别以HindⅢ+BamHⅠ游离插入片段，回收后连接至pAluc的相应位点构成质粒pH16-7612，pPM-D-7612和pPM-P-7612。

质粒pH16-7759，pPM-D-7759和pPM-P-7759构建如下：分别以质粒pH16-7004，pPM-D-7004和pPM-P-7004为模板，H16-7759（5′-CTTCTAAGGCCAACTAAATGT-3′，）和H16-123为引物进行PCR扩增；扩增产物经T4多聚核苷酸激酶以及DNA聚合酶Ⅰ大片段作用后，平端连接至pSP6-64载体上；分别以HindⅢ+BamHⅠ游离插入片段，回收后连接至pAluc的相应位点构成质粒pH16-7759，pPM-D-7759和pPM-P-7759。

质粒pH16-7843，pPM-P-7843 和pC-7843构建如下：分别以质粒pH16-7004和pPM-pro-7004为模板，H16-7843（5′-ACTGCACATGGGTGTGTGCAAACCGTTTT

GGGGT-3′）和H16-123以及T432-7843（5′-ACTGCACGTGGGTGTGTGCAAACCGTTTTGGGGT-3′）和H16-123为引物进行PCR扩增；以质粒pH16-7004为模板，C-7843（5′- ACTGCACGCTACTGTGTGCAAACCGTT

TTGGGGT-3′）和H16-123为引物进行PCR扩增（划线部分为突变核苷酸）；扩增产物经T4多聚核苷酸激酶以及DNA聚合酶Ⅰ大片段作用后，平端连接至pSP6-64载体上；分别以HindⅢ+BamHⅠ游离插入片段，回收后连接至pAluc的相应位点构成质粒pH16-7843，pPM-P-7843和pC-7843。

质粒pC-7004构建如下：采用PCR定位突变法以质粒pBS-H16-7004为模板，第一部分引物为reverse引物（5′-AACAGCTATGACCATG-3′，pBS M13⁺序列）和H16-LS (5′-TTTACAAATGAACAATGTATG-3′)；第二部分引物为C-7836M和13-20 (5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′，pBS M13⁺序列)。PCR产物分别经HindⅢ（第一部分）和BamHⅠ（第二部分）水解后插入到pUC-19相应位点，进一步亚克隆至pAluc上。质粒pC-7463构建如下：以SphⅠ水解克隆在pUC-19上的pC-7004插入片段，除去HPV16 nt 7004～7462 间的LCR序列，自身环化连接；以HindⅢ+BamHⅠ分别游离克隆的LCR序列（nt 7463～123），回收后分别连接至pAluc的相应位点构成质粒pC-7463。

细胞培养及转染：子宫颈癌细胞系C33a在含10%小牛血清的DMEM培养液中生长。细胞转染采用磷酸钙法^〔3〕，2μg质粒DNA，0.5μg pRSV-β-gal DNA与250mmol/L CaCl₂，1×HBS缓冲液(280mmol/L NaCl, 10mmol/L KCl, 1.5mmol/L Na₂HPO₄, 50mmol/L HEPES)室温作用20min。将作用后的DNA滴加至60mm约(70～80)%生长丰度的单层细胞培养皿中。次日PBS洗后换液。转染48h后收集细胞，经4次反复冻融，离心收集上清。

荧光素酶(luciferase)检测：取10μl转染细胞提取物加至100μl测定液(0.1mmol/L K₂PO₄, 15mmol/L MgSO₃, 50mg/ml ATP)在荧光素酶测定仪内与10ng D-luciferin (Boeringer公司产品)反应10s，自动测定荧光素酶数值。取20μl细胞提取物与30μl 0.4μg/ml ONPG (Sigma公司产品)37℃作用1h，420nm测定的A值为β-gal表达数值。荧光素酶表达值为荧光素酶值与β-gal值之比。

结果

YY1蛋白可同多种细胞及病毒活性因子发生分子间相互作用，从而影响甚至改变其生物学效应。在HPV16 LCR序列上位于YY1结合位点上游的组织特异性增强子包括了许多转录增强因子的结合位点。为了观测增强子是否影响YY1蛋白对启动子P97活性的抑制效应，我们构建了不同长度的HPV16野毒株和突变株LCR荧光素酶报道基因质粒（图1）。7004系列为HPV16全长LCR序列，7643系列的LCR序列起始于增强子的起始端，7612系列起始于增强子的中部，7759系列的LCR序列去除了全部增强子区域，7836系列仅带有一个启动子近端的YY1位点。

图1不同5′-端缺损LCR质粒在HPV16 LCR序列上的位置

Fig 1. Position of different 5′-deleted LCR plasmids in HPV16 LCR

The numbers of the initiating nucleotide of pla