【 摘要 】目的构建pBV-BPI₆₀₀-Fcγ1₇₀₀重组表达载体，转化E.coli DH5α诱导表达BPI₂₃-Fcγ1抗菌重组蛋白。 方法采用RT-PCR技术，从HL-60细胞和正常人白细胞mRNA中扩增编码BPI₂₃和IgG1Fc（Fcγ1）的基因；通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体；转化感受态E.coli DH5α细胞，通过温控诱导表达BPI₂₃-Fcγ1重组蛋白。 结果(1) RT-PCR获得预期的扩增产物BPI_600bp和Fcγ1_700bp基因片段；(2) 成功构建pUC18-BPI₁₈₀、pUC18-BPI₄₂₀、pUC18-Fcγ1₇₀₀重组克隆载体，DNA测序结果与文献报道一致；(3) 成功构建pBV-BPI₆₀₀-Fcγ1₇₀₀重组表达载体，酶切图谱分析与预期结果相符；(4) 转化感受态E.coli DH5α细胞，通过温控诱导表达BPI₂₃-Fcγ1重组蛋白，表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%；(5) 复性后重组蛋白具有抗菌活性和结合蛋白A的作用。 结论pBV-BPI₆₀₀-Fcγ1₇₀₀重组表达载体构建成功；在E.coli中得到表达，获得具有抗菌活性的BPI₂₃-Fcγ1重组蛋白。

Expression of recombinant BPI₂₃-Fcγ1 fusion protein in E. coli

KE Yan, AN Yunqing, YANG Guizhen.

（Department of Microbiology and Immunology, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054, P. R. China）

【 Abstract 】ObjectiveTo express BPI₂₃-Fcγ1 anti-bacteria recombinant fusion protein. MethodsBPI₂₃ and Fcγ1 genes were isolated by RT-PCR from HL-60 and normal human leukocytes and inserted into expression vector pBV and the fusion protein expressed in E. coli DH5α in a temperature-induced manner. Results The expressed BPI₂₃-Fcγ1 fusion protein constituted 20%～30% of total bacterial protein. The renatured BPI₂₃-Fcγ1 recombinant protein showed biological activities of anti-bacteria and was able to form conjugate with protein A. ConclusionpBV-BPI₆₀₀-Fcγ1₇₀₀ recombinant expression vector was successfully constructed, and BPI₂₃-Fcγ1 recombinant protein with anti-bacteria activities was expressed in E. coli.

【 Subject words 】pVB-BPI₆₀₀-Fcγ1₇₀₀ recombinant expression vector; BPI₂₃-Fcγ1 recombinant protein; RT-PCR

革兰阴性细菌败血症(Gram-negative sepsis, GNS)及其休克有很高的死亡率^〔1〕，传统抗菌素治疗^〔2〕和采用抗脂多糖类脂A单克隆抗体或抗IL-1、TNF单克隆抗体进行免疫治疗均未获得令人满意的效果^〔3〕。杀菌/渗透-增强蛋白(bactericidal / permeability increasing protein, BPI) 的研制成功为GNS及其休克的防治带来希望。BPI是微量存在于多形核白细胞颗粒中一种相对分子质量（M_r）为56×10³的阳离子抗菌蛋白^〔4〕。研究表明，rBPI₅₆或其M_r为23×10³的功能性氨基端片段（rBPI₂₃）与天然BPI具有完全相同的生物学作用。它们对G^-菌和细菌脂多糖有很高的亲和力，不仅能广谱杀伤G^-菌并能有效中和细菌内毒素^〔5〕。但药物动力学研究表明，rBPI₅₆或rBPI₂₃在体内的半衰期太短(＜1h)^〔6〕，因此影响其临床疗效。

Ig样重组蛋白是采用基因工程技术制备的由某种功能性小分子多肽或蛋白与Ig Fc片段嵌合而成的一种重组蛋白。该种Ig样重组蛋白不仅具有多肽或蛋白所特有的生物学功能，而且兼备Ig固定补体和较长血清半衰期等特性^〔7〕。据此，我们希望制备一种由BPI₂₃与IgG Fc片段嵌合而成的重组蛋白，以期获得良好的临床治疗效果。本文主要工作如下：（1）采用RT-PCR技术，分别从HL-60细胞和正常人白细胞mRNA中扩增出编码BPI₂₃和Fcγ1的基因片段(BPI_600bp和Fcγ1_700bp)；（2）构建pBV-BPI₆₀₀-Fcγ1₇₀₀重组表达载体，转化E.coli DH5α诱导表达BPI₂₃-Fcγ1重组蛋白；（3）重组蛋白复性和生物学活性的初步测定。

材料与方法

细胞、菌株和质粒载体：HL-60细胞为本实验室保存细胞株；白细胞获自正常人外周血。E.coli DH5α为本实验室保存菌株。克隆载体pUC18质粒购自北方同正生物工程公司；表达载体pBV220质粒^〔8〕由中国预防医学科学院病毒所馈赠。

主要试剂：限制性内切酶(EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ、SmaⅠ)及其它修饰酶购自Promega公司；HRP标记羊抗人IgG抗体购自北京中山生物技术有限公司；mRNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、质粒提取纯化试剂盒购自Promega公司；DNA回收纯化试剂盒购自原平皓生物制品公司；发光试剂盒购自Santa Cruz Biotechnology公司；Sephadex G-100和Sepharose CL-4B protein A购自Pharmacia公司。

引物设计与合成：根据已知人BPI基因序列，设计合成第一对引物：P1 5′CAGAATTCATGGTCAACCCT

GGCGTCGTG3′；P2 5′GCAAGCTTCTATTTTGGTCATTAC

TGGCAG3′。5′端引物P1不含N端信号肽序列，含有EcoRⅠ酶切位点和起始密码子ATG；3′端引物P2含有HindⅢ酶切位点。该对引物所扩增的基因为编码BPI N端1～199个氨基酸的基因。根据已知人IgG基因序列，设计合成第二对引物：P3 5′GTAAGCTTCTACATGCCCACCGTGCCCAG3′；P4 5′TCGGATCCTTATTTACCCGGAGACAGGGAG3′。5′端引物P3含有HindⅢ酶切位点，3′端引物P4含有BamHⅠ酶切位点和TAA终止密码子^〔9〕。该对引物所扩增的基因为编码Fcγ1的基因。上述引物均由上海生工生物工程公司合成。

RT-PCR扩增获得目的基因：按mRNA提取试剂盒说明，从HL-60细胞和正常人白细胞中提取mRNA后进行RT-PCR。反应程序按RT-PCR一步法试剂盒说明进行，即48℃逆转录45min，94℃变性2min后进行40个PCR循环。循环参数：94℃变性30s，53.5℃复性40s，72℃延伸45s，末次循环后再延伸5min。

取扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳。根据相对分子质量marker标示，从琼脂糖凝胶上切下含目的基因片段的凝胶，按DNA快速纯化回收试剂盒操作步骤纯化回收扩增产物。

pUC18-BPI₁₈₀、pUC18-BPI₄₂₀、pUC18-Fcγ1₇₀₀重组克隆载体的构建、筛选和鉴定：用EcoRⅠ和HindⅢ对BPI_600bp进行双酶切获得BPI_180bp和BPI_420bp2个DNA片段，同时用EcoRⅠ和EcoRⅠ/ HindⅢ分别对pUC18质粒进行酶切反应，前者（EcoRⅠ酶切产物）经去磷酸化处理后，通过连接反应与BPI_180bp结合构成pUC18-BPI₁₈₀重组克隆载体；后者（EcoRⅠ/HindⅢ酶切产物）通过连接反应与BPI_420bp结合构成pUC18-BPI₄₂₀重组克隆载体。用HindⅢ / BamHⅠ分别对Fcγ1_700bp和pUC18进行酶切反应后，通过连接反应获得pUC18-Fcγ1₇₀₀重组克隆载体。上述重组克隆载体转化DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆菌。小提质粒后，分别用EcoRⅠ、EcoRⅠ/ HindⅢ、HindⅢ / BamHⅠ处理进行酶切分析；再用PstⅠ、EcoRⅠ/ PstⅠ、SmaⅠ处理进行酶谱鉴定。以上各步均参照文献〔10〕进行。

DNA序列分析：从阳性克隆菌中小量提取质粒DNA，以M13 reverse primer为引物进行全自动测序(由北京赛百盛生物工程公司测定)。

pBV-BPI₆₀₀-Fcγ1₇₀₀重组表达载体的构建：通过EcoRⅠ、EcoRⅠ/ HindⅢ、HindⅢ / BamHⅠ酶切反应，从pUC18-BPI₁₈₀、pUC18-BPI₄₂₀和pUC18-Fcγ1₇₀₀重组克隆载体中酶切获得BPI_180bp、BPI_420bp、Fcγ1_700bp的基因片段。同时用EcoRⅠ/ BamHⅠ酶切pBV220表达载体，然后通过连接反应，首先将BPI_420bp和Fcγ1_700bp基因片段连接到pBV220上构建成pBV-BPI₄₂₀-Fcγ1₇₀₀重组表达载体。该重组表达载体经EcoRⅠ单酶切和去磷酸化处理后再与BPI_180bp基因片段进行连接反应，获得pBV-BPI₆₀₀-Fcγ1₇₀₀重组表达载体，转化E.coli DH5α感受态细胞得到阳性克隆菌。

BPI₂₃-Fcγ1重组蛋白的诱导表达、提取和鉴定：将阳性克隆菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，30℃条件下振荡培养，当菌液吸光度值（A600）达到0.4～0.6时，立即转入42℃条件下诱导表达，6h后离心收集细菌，在冰浴中以间歇法超声破碎菌体，收集包涵体沉淀。用含4mol/L尿素的洗液反复洗涤包涵体后进行SDS-PAGE^〔10〕，用Bio-Rad GS-700薄层扫描仪测定重组蛋白表达率。同时进行Western blot鉴定。

BPI₂₃-Fcγ1重组蛋白的复性、纯化和抗菌活性的初步测定：将包涵体溶于含8mol/L尿素的裂解液中使蛋白变性后，通过Sephadex G-100凝胶层析获得粗制重组蛋白，<