【 摘要 】目的研制能封闭血管内皮生长因子（VEGF）受体KDR的单克隆抗体（McAb），探讨其抑制VEGF诱导的体内外活性。 方法以原核表达的KDRⅠ～Ⅳ区融合蛋白免疫BALB/c小鼠，用杂交瘤技术制备抗KDRⅠ～Ⅳ的McAb，并用免疫双扩、ELISA和Western免疫印迹鉴定其亚类和抗原结合特异性，用VEGF刺激内皮细胞增殖及鸡胚血管形成实验检测该抗体的中和活性。 结果通过筛选和鉴定获得了2株KDRⅠ～Ⅳ区McAbs（3G9、1E4），其分泌抗体亚类分别为IgG1和IgM。2株McAb均能明显抑制VEGF诱导的内皮细胞(EC)增殖，经纯化的McAb 3G9能明显抑制经VEGF刺激的鸡胚血管形成。 结论KDRⅠ～Ⅳ区McAb可能通过封闭内源性KDR而抑制VEGF活性，McAb 3G9具有潜在治疗肿瘤的应用前景。

Inhibition of monoclonal antibodies against extracellular Ⅰ-Ⅳ domains of vascular endothelial cell growth factor receptor KDR on the proliferation EC and formation of chicken embryo blood vessels

SONG Shumei, WU Jian, SHOU Chengchao

（School of Oncology, Peking University, Beijing 100034, P. R. China）

【 Abstract 】ObjectiveTo prepare monoclonal antibodies against extracellular domains of KDR for blocking the action of VEGF, fusion-protein of KDR Ⅰ-Ⅳ expressed in E.coli. MethodsXL-1Blue was used for immunizing BALB/c mice. McAbs against KDR Ⅰ-Ⅳ were prepared by hybridoma technique and double immuno-diffusion; ELISA and Western blot identified their immunoglobulin subclass and specificity. The activities of KDR Ⅰ-Ⅳ McAbs neutralizing VEGF were also detected. ResultsOur study showed that 3G9, 1E4 McAbs were IgG1 and IgM respectively and could specifically reacted with KDRⅠ-Ⅳ. Both 3G9 and 1E4 could obviously suppress proliferation of EC induced by VEGF. Purified McAb 3G9 inhibited formation of chicken embryo blood vessels. ConclusionMcAbs against KDR Ⅰ-Ⅳ could suppress the action of VEGF by blocking native vascular endothelial cell growth factor receptor KDR, and are therefore potential for tumor biotherapy.

【 Subject words 】VEGF; VEGF receptor; McAb

KDR是血管内皮生长因子（VEGF）的主要受体之一，它在介导VEGF的内皮细胞增殖、血管形成及血管通透性等生物活性中起非常重要的作用^〔1〕。KDR属酪氨酸激酶第Ⅲ亚型，胞外含7个免疫球蛋白区域。有报道表明，KDR胞外Ig样domain 2属VEGF结合区，而domain 1和domain 3对受体与配基的结合起一定作用，domain 4能维持受体的二聚体化^〔2〕。为了最大限度地达到能封闭VEGF与内源性KDR受体结合，我们选择KDR胞外Ⅰ～Ⅳ区的表达产物作为抗原免疫小鼠，制备相应的McAb，并研究其体内外抑制VEGF功能的活性，以期获得能抑制VEGF功能进而抑制肿瘤血管形成的抗肿瘤血管治疗试剂。

材料和方法

实验材料：人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）由中国预防医学科学院病毒所遗传室惠赠，KDRⅠ～Ⅳ区蛋白表达、提取和纯化参见文献〔3〕。HAT(选择培养剂)为Sigma公司产品。人重组VEGF₁₆₅为Heparin-Sepharose^TM Chroma-tography纯化试剂，购自美国Upstate Biotechnology Co.，体外活性ED₅₀近似1.0ng/ml。

¹²⁵I-VEGF购自美国Life Technologies Inco.；³H-TdR购自中国科学院原子能研究所；MTT为Sigma公司产品；种鸡蛋购自北京市丰台区种鸡场。

抗KDRⅠ～Ⅳ区McAb的制备：用纯化的KDRⅠ～Ⅳ重组蛋白免疫BALB/c小鼠，50μg/只，采用常规杂交瘤技术进行单抗制备。

抗KDRⅠ～Ⅳ区McAb的鉴定

亚类鉴定：取杂交瘤上清15ml加等量饱和硫酸胺, 混匀, 4℃过夜，次日10000r/min离心10min，沉淀用500μl ddH₂O溶解以备检测；采用免疫双扩法进行3G9和1E4 McAb的亚类测定，抗亚类抗体试剂盒购自Sigma公司。

特异性鉴定：以KDRⅠ～Ⅳ区蛋白及其它无关蛋白BSA、3H11、P21、Flt-1、KDRⅤ～Ⅶ包被96孔板，按常规ELISA法检测其反应特异性；此外，以纯化KDRⅠ～Ⅳ抗原包板，将纯化3G9 McAb进行5倍稀释观察不同浓度McAb与抗原的特异性反应，并以正常鼠IgG作阴性对照。

Western印迹检测：按文献〔4〕进行，500ng纯化KDR蛋白行SDS-PAGE并转移至NC膜上，NC膜经3%BSA封闭后与KDRⅠ～Ⅳ区McAb 3G9、1E4上清及纯化3G9反应，经酶标二抗及DAB显色观察KDRⅠ～Ⅳ单抗与KDR抗原的反应性。

KDRⅠ～Ⅳ McAb体外活性研究

细胞计数方法：消化贴壁生长的HUVEC细胞，调整细胞浓度至4×10⁴细胞/ml (10%FCS, RPMI 1640), 接种于24孔板，0.5ml/孔，37℃继续培养24h后换成0.4% FCS的培养液饥饿培养24h，分别加入KDRⅠ～Ⅳ McAb 3G9和1E4, 同时加入hrVEGF₁₆₅(2ng/ml), 并设单独VEGF刺激组及PBS对照和KDRⅤ～Ⅶ McAb（Kab）作对照；48h后进行计数并与对照组进行比较。

³H-TdR掺入法检测3G9或1E4 对EC DNA合成的影响：按细胞记数方法相同操作，接种HUVEC细胞至96孔培养板（每孔2×10³/100μl）；24h后换用0.4% FCS培养液，继续培养24h，分别将3G9和1E4杂交瘤上清（10μl/孔）及VEGF（2ng/ml）同时加入实验组，并设单独VEGF刺激组及PBS对照组，在37℃ 5% CO₂中培养48h后，再加入³H-TdR 18.5kBq(0.5μCi)/孔，继续作用6～8h，吸出培养液，用胰酶消化细胞，多头细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维膜上并用95%酒精固定。将玻璃纤维膜置于盛2.5ml液闪液的闪烁瓶中，液体闪烁计数器测定各孔cpm值，每组4孔，重复3次。

KDR McAb 3G9体内对鸡胚绒毛尿囊膜血管形成抑制效应测定：参考文献〔5〕加以改进，将孵化第6天鸡胚开窗加药，将直径为3 mm的圆形玻璃纤维膜放在绒毛尿囊膜血管较少部位，然后将纯化3G9(1.5mg/ml)和VEGF(200ng/ml)各15μl同时加在膜上，并设单独VEGF刺激组及PBS对照，38℃孵育箱培养48h后观察各组鸡胚血管发育情况。

结果

1.KDRⅠ～Ⅳ区McAb的制备及筛选：将免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，HAT培养液选择培养，融合率为100%(328孔/328孔)，于融合后第9天进行ELISA双筛选。结果筛选的328孔中，有11孔呈GST-KDR单阳性，故将该11孔进行第一次亚克隆，此后反复进行ELISA筛选及亚克隆3～6次，直至每个单克隆均为KDR特异强阳性为止。筛选出2株能稳定分泌抗人KDRⅠ～Ⅳ的杂交瘤细胞株，分别命名为3G9和1E4。

2.KDRⅠ～Ⅳ区McAb 3G9和1E4的鉴定

（1）亚类鉴定：应用免疫双扩法测得3G9和1E4的亚类分别为IgG1和IgM。将3G9和1E4杂交瘤扩大培养，均能诱导BALB/c小鼠产生抗人KDRⅠ～Ⅳ的腹水，腹水产量为3～8ml/只，效价分别达10^-6和10^-5。由于3G9属IgG1亚类，故选用高盐-蛋白A-Sepharose-4B进行纯化。

（2）特异性鉴定：为分析KDRⅠ～Ⅳ McAb 3G9和1E4的特异性，将KDRⅠ～Ⅳ抗原及其它无关蛋白包被96孔板，ELISA法检测3G9与抗原的特异性反应。结果McAb 3G9和1E4仅与KDRⅠ～ Ⅳ有特异性反应，与其它无关蛋白如BSA、GST-P21、GST-3H11及GST-KDR Ⅴ～Ⅶ区蛋白均无特异性结合活性。选取McAb 3G9行5倍倍比稀释用ELISA检测其与抗原KDRⅠ～Ⅳ的反应性，结果随纯化3G9抗体浓度升高，与KDRⅠ～Ⅳ的结合活性也随之增加，而正常鼠IgG（nM-IgG）无相应的特异性反应(图1)。

(3)Western blot免疫印迹鉴定：将KDRⅠ～Ⅳ阳性表达菌或适当稀释的纯化KDRⅠ～Ⅳ抗原，行SDS-PAGE并转移至NC膜上，用3G9及1E4杂交瘤上清或1∶1000稀释的纯化3G9进行结合反应，结果表明，3G9及1E4上清或纯化的3G9抗体均与抗原有一特异反应带，而nM-IgG无相应反应(图2)。

3.KDRⅠ～Ⅳ McAb对内皮细胞(EC)增殖的抑制活性

(1)用计数法观察3G9或1E4对VEGF刺激EC增殖的抑制作用：将3G9或1E4杂交瘤上清加入去除血清24h后的EC(HUVEC)培养液中，使杂交瘤上清体积占总体积的10%，作用48h后进行细胞计数，结果如图3所示，KDRⅠ～ⅣMcAb 3G9和1E4均能显著抑制VEGF所致的EC增殖。此外，还可能抑制部分内源性VEGF对EC的刺激作用。而对照KDRⅤ～Ⅶ区单抗Kab及PBS则对VEGF引起的EC增殖无明显抑制作用。

图1ELISA法检测KDRⅠ～Ⅳ McAb(3G9)的特异性

Fig 1. Specificities of KDRⅠ～Ⅳ McAb 3G9 by ELISA

图2KDRⅠ～Ⅳ区McAb的Western blot分析

Fig 2. Western blot results of KDRⅠ～Ⅳ protein w