【 摘要 】目的获得小鼠粘膜血管定居因子(MAdCAM-1)分子剪切体cDNA，并在原核细胞中进行有效表达。方法 从BALB/c小鼠的肠系膜淋巴结中提取总RNA，利用RT-PCR方法获得小鼠MAdCAM-1分子剪切体cDNA，构建原核表达载体并进行表达，纯化融合蛋白制备多抗。 结果核酸序列分析表明获得了正确的小鼠MAdCAM-1分子剪切体cDNA；小鼠MAdCAM-1剪切体以融合蛋白的形式得到表达，主要以包涵体形式存在；免疫印迹分析表明，小鼠MAdCAM-1剪切体蛋白可被小鼠MAdCAM-1分子的标准单抗及自制多抗识别。 结论 小鼠MAdCAM-1剪切体cDNA、表达蛋白及多抗的获得，为进一步研究该分子的生物学活性做好准备。

Cloning and protein expression of mouse MAdCAM-1 spliced variant

ZHANG Huiying, GAO Jieying, LUO Zhen′ge

（Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100850, P.R.China）

【 Abstract 】ObjectiveTo obtain the spliced mouse mucosal addressin cell adhesion molecule-1 (mMAdCAM-1) cDNA and express it in E.coli. MethodsObtaining the spliced mMAdCAM-1 cDNA from mesenteric lymph nodes of BALB/c mice by RT-PCR, cloning the cDNA into the procaryotic expressive vector pGEX-2T and expressing the fusion protein. ResultsAfter identified by DNA sequencing, the fusion protein was expressed and mainly existed as inclusion bodies. After purification, we prepared the multi clonal-antibody to the fusion protein. The spliced mMAdCAM-1 protein was identified by the multi clonal-antibody and standard monoclonal antibody against mMAdCAM-1 with Western blot. ConclusionThe spliced mMAdCAM-1 cDNA, expressed protein and multi clonal-antibody can support the further research about the biological activities of mMAdCAM-1.

【 Subject words 】Mouse mucosal addressin cell adhesion molecule-1 (mMAdCAM-1); Protein expression

mMAdCAM-1分子（mucosal addressin cell adhesion molecule-1）也称粘膜血管定居因子，是粘附分子免疫球蛋白超家族中的一员。它主要表达于肠道相关淋巴组织和固有层血管内皮细胞上，它同淋巴细胞上的归巢（homing）受体分子整合素α4β7及选择素L-selectin结合，介导淋巴细胞向粘膜部位的定向归巢。另外，该分子还参与某些部位的炎症过程^〔1-3〕。完整的mMAdCAM-1分子由信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区四部分组成，胞外区由3个Ig样结构域和一个糖基化的mucin-样区域构成，N-端的两个Ig样结构域与受体α4β7结合时起重要作用，mucin-样区域是与L-selectin发生作用的部位。mMAdCAM-1剪切体是缺失第四个外显子形成的，缺失mucin-样区域和近膜Ig样结构域，不能与L-selectin结合，但仍保持着与整合素α4β7分子结合的特性^〔4〕。mMAdCAM-1分子剪切体变短并丧失了与L-selectin结合的能力，将影响其与淋巴细胞间的结合，目前认为其功能可能在于调节mMAdCAM-1分子与淋巴细胞的相互作用。

本文研究获得了mMAdCAM-1分子剪切体cDNA，并将其在原核细胞中进行表达，制备相应抗体，为今后深入研究mMAdCAM-1分子剪切体生物学功能提供便利条件。

材料与方法

质粒与菌株、动物： 菌株JM109、JM101、DH5α、HB101、XL-1Blue、BL-21为本室保存；质粒pGEX-2T由本室保存。BALB/c小鼠6～8周龄，大耳白兔由本院动物中心提供。

主要试剂：pGEM-T载体质粒、质粒提取试剂盒、AMV逆转录酶及Taq DNA聚合酶为Promega公司及上海生工公司产品，T4 DNA连接酶及限制性内切酶等购于华美生物工程公司、天象人生物工程公司等；DNA快速回收纯化试剂盒购于原平生物工程公司；谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析介质购于Pharmacia公司；大鼠抗小鼠MAdCAM-1分子单抗MECA-367，购于Pharmingen公司；生物素标记的羊抗大鼠IgG、羊抗兔IgG及蛋白marker，亲和素标记HRP均由本室制备。

引物设计及目的片段的钓取：根据文献报道的mMAdCAM-1核酸序列设计引物^〔5，6〕，两端加有BamHⅠ酶切点，下游引物终止密码子由TGA改为大肠杆菌偏性密码子TAA，能扩增出编码成熟mMAdCAM-1分子剪切体多肽的cDNA序列。上游引物:5′CCGGATCCGGACAGTCCTTCCAGGTG 3′； 下游引物:5′AGGATCCTTATAGGTGTGTACATGAGCT 3′利用异硫氰酸胍一步法^〔7〕从BALB/c小鼠的肠系膜淋巴结（MLN）中提取总RNA，通过RT-PCR反应获得目的基因片段。

DNA片段的回收、纯化，质粒的转化、提取和纯化、连接反应：见参考文献〔8〕及相关产品说明书。DNA序列测定由赛百盛公司完成。

原核表达载体的构建：将扩增得到的mMAdCAM-1分子剪切体的cDNA片段克隆于pGEM-T中，经DNA测序分析正确后，利用BamHⅠ位点将cDNA片段切下，连入pGEX-2T载体的相应位点，获得重组表达载体pGEX-2T-SM。

融合蛋白的诱导表达及纯化：表达菌过夜活化后按1%接种量进行培养，37℃，2～4h；IPTG诱导2～4h。超声破碎菌体，收集上清和沉淀。①亲和层析法纯化：利用亲和层析介质谷胱甘肽-Sepharose 4B进行纯化，方法见说明书。②包涵体初步纯化：菌体沉淀分别用含2% Triton-X-100的2mol/L脲、4mol/L脲洗涤2次后，溶于8mol/L脲中，加入1mmol/L DTT，室温放置1.5h，12000×g离心20min，保存上清。用9倍体积的50mmol/L KH₂PO₄（pH10.7）、1mmol/L EDTA（pH8.0）、50mmol/L NaCl溶液稀释上清，室温放置半小时，并加KOH维持溶液，pH值为10.7。用HCl将溶液的pH值调至8.0，室温放置半小时后，12000×g离心15min，用50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）的缓冲液透析上清过夜。测定蛋白浓度，分装后于-20℃保存。

凝血酶酶切反应：125mmol/L NaCl、2.5mmol/L CaCl₂、50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中进行酶切反应，融合蛋白与凝血酶的蛋白比例分别为1005，1003，1002，1001，25℃反应2h。

mMAdCAM-1剪切体融合蛋白的多抗制备：按常规方法进行，每只家兔融合蛋白的用量为0.2mg蛋白/次。

免疫印迹分析：对蛋白进行SDS-PAGE后，按常规方法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，分别用自制抗mMAdCAM-1兔血清 及mMAdCAM-1标准单抗MECA-367反应，生物素标记羊抗兔及羊抗大鼠IgG作为二抗进行检测，亲和素标记的HRP进行DAB显色。

结果

1. mMAdCAM-1分子剪切体cDNA的获得：利用合成引物对小鼠MLN总RNA进行RT-PCR扩增反应， 扩增产物经凝胶电泳分析表明：扩增片段大小约为0.7kb，与缺失信号肽的mMAdCAM-1分子剪切体cDNA大小相当。

2.原核重组表达载体的构建：将RT-PCR获得的扩增片段与载体pGEM-T连接，经核酸序列分析表明与文献报道的mMAdCAM-1分子剪切体cDNA序列完全一致。利用BamHⅠ将cDNA片段从重组质粒pGEM-SM2中切下，与表达载体pGEM-2T连接，经酶切鉴定筛选出正向连接重组表达质粒pGEM-2T-SM。

3. mMAdCAM-1剪切体蛋白的表达：分别对含质粒pGEX-2T的载体菌和质粒pGEX-2T-SM的重组菌进行 IPTG诱导表达。结果表明载体菌在相对分子量（M_r)为26×10³处有高表达蛋白，其大小与载体蛋白GST完全一致，是诱导表达的载体蛋白，在上清和沉淀中都存在；而重组菌在M_r约为59×10³处有新的蛋白产生，其大小与推测的mMAdCAM-1剪切体融合蛋白M_r相一致，薄层扫描显示该蛋白占菌体蛋白的44.3%，其主要以包涵体形式存在于沉淀中，上清液中诱导表达的融合蛋白含量很低（见图1）。

图1SDS-PAGE检测诱导表达蛋白

Fig 1.SDS-PAGE of induced expression proteins

1. Protein markers； 2，3，4. Lysate, supernatant and precitation of vector strain； 5，6，7. Lysate, supernatant and precitation of combinant strain

为了增加融合蛋白的可溶性表达，我们分别将pGEX-2T-SM表达质粒转入到JM101、JM109、HB101、DH5α、XL-1Blue及BL-21几个不同大肠杆菌中进行表达，结果发现融合蛋白在这些菌体中都可得到表达，而且表达的量相近，但仍主要以包涵体形式存在；通过改变诱导条件的方式也未能奏效。

4.载体蛋白和融合蛋白的纯化：采用亲和层析介质谷胱甘肽-Sepharose 4B对载体蛋白GST及融合蛋白进行纯化，结果表明，纯化的载体蛋白纯度高，达电泳纯，蛋白含量约为0.9mg/ml。而得到的mMAdCAM-1剪切体融合蛋白含量少，并有少许杂蛋白存在。为了获得大量的纯化蛋白，我们对包涵体进行初步纯化，结果表明，获得的融合蛋白纯度可达63.8 %左右，蛋白质含量为0.4～0.5mg/ml（见图2）。