【 摘要 】目的利用噬菌体展示技术寻找胸腺基质细胞表面的新抗原。 方法用培养的胸腺基质细胞系MTDC作为靶抗原富集初级噬菌体抗体库，从经过富集后的次级抗体库中挑选克隆，制备单链抗体，并在冰冻切片及培养的细胞系上检测抗体的特异性。 结果从经4轮富集的次级抗体库中挑选到一个新的克隆。用此克隆制备的单链抗体可同时辨认胸腺髓质上皮细胞亚群和胸腺树突状细胞亚群。 结论胸腺髓质上皮细胞和胸腺树突状细胞均具有异质性，同时噬菌体展示技术可以作为寻找细胞表面新分子的强有力工具。

A new surface antigen shared by subsets of thymic medullary epithelial cells and thymic dendritic cells recognized by a novel single chain antibody

JIANG Yufei

（Department of Immunology, Beijing University Health Science Center, Beijing 100083, P.R.China）

CHEN Weifeng, Willem van Ewijk

【 Abstract 】ObjectiveTo search for new antigens expressed on the surface of thymic stromal cells using phage display technology. MethodsThe primary phage library was selected with thymic dendritic cell line MTDC to obtain subtracted library. The positive clones were picked up from subtracted library and single chain antibodies were made from these clones. The reactivities of single chain antibodies were tested on mouse frozen sections and various mouse cultured cell lines. ResultsFrom the subtracted library of fourth round selection we obtained one new clone. Single chain antibody derived from this clone can recognize a new antigen expressed on the surface of subsets of both thymic medullary epithelial cells and thymic dendritic cells. ConclusionBoth epithelial cells and dendritic cells are highly heterogeneous in thymic medulla. Phage display technology can be used as a powerful tool in searching for new antigens on thymic stromal cells.

【 Subject words 】Phage display; Single chain antibody; Thymic medullary epithelial cell; Thymic dendritic cell

免疫系统发挥正常的生理功能需要功能正常的免疫细胞，免疫细胞的重要成分之一，T细胞主要是在胸腺中产生的^〔1〕。胸腺前体细胞进入胸腺以后，通过与胸腺微环境中各种成分相互作用经历阳性选择与阴性选择而形成功能成熟的T细胞^〔2〕。现在人们普遍认为胸腺皮质中的上皮细胞介导了阳性选择过程^〔3〕，经过这一阶段，那些与自身MHC分子能够结合的胸腺细胞存活下来，下调CD4或CD8，进入胸腺髓质。髓质中这些功能并不十分成熟的单阳性细胞要在髓质区基质细胞的帮助下分化成功能完全成熟的单阳性细胞，包括上调表达H-2和Qa-2抗原^〔4，5〕。目前，在髓质中的胸腺细胞的成熟过程还不是很清楚，但普遍认为阴性选择发生在髓质^〔6〕。髓质中的基质细胞主要包括髓质的上皮细胞和来源于骨髓的树突状细胞，现在人们普遍认为主要是树突状细胞在阴性选择过程中起关键性的作用^〔7〕。为了对髓质的基质细胞有更进一步的了解，我们应用噬菌体展示技术来寻找其表面的新分子，以期获得髓质区基质细胞在胸腺细胞发育过程中的影响方面的信息。

材料和方法

噬菌体抗体库：由Utrecht Universtity Hospital的Ton Logtenberg教授惠赠^〔8〕。

细菌菌株、辅助噬菌体：E.coli XL1-Blue为抑制型大肠杆菌，用于噬菌体抗体库的扩增。E.coli SF110为非抑制型大肠杆菌，用于生产单链抗体，均由Ton Logtenberg教授惠赠。辅助噬菌体M13K07 购自Gibco/BRL公司。

细胞系：(1) 胸腺树突状细胞系MTDC^〔9〕，(2) 胸腺皮质型上皮细胞系TEC1C8^〔10〕，(3) 胸腺髓质型上皮细胞系TEC1C6^〔10〕、MTEC1^〔11〕，(4) 胚胎皮肤树突状细胞系FSDC^〔12〕，(5) 脾脏树突状细胞系D2SC^〔13〕，(6) 巨噬细胞系RAW264.7^〔14〕，所有细胞均培养于含5% CO₂的37℃孵箱中，所用培养基为RPMI 1640并辅以10%胎牛血清。

新鲜胸腺细胞、脾细胞的制备：取4周龄BALB/c小鼠处死后取出胸腺、脾，用剪刀剪碎，放在100目的筛网上用PBS缓冲液冲洗胸腺及脾的碎块。收集过滤后成分，1500r/min离心10min，重悬于含10% 胎牛血清的PBS缓冲液中，制成新鲜胸腺细胞和脾细胞悬液。

噬菌体抗体库的富集：初级噬菌体抗体库首先和10⁷的胸腺细胞与脾细胞混合进行预吸收。离心去除细胞后将上清与10⁵ MTDC细胞在室温下孵育2h，然后弃去上清，用含10%胎牛血清的PBS缓冲液振荡洗涤细胞20次以去除非特异结合的噬菌体。最后离心弃去上清，将细胞重悬于200μl 76mmol/L 枸橼酸溶液中，在室温下孵育5min以洗脱结合在细胞上的表达特异抗体的噬菌体。加入800μl 1mol/L的Tris-HCl(pH7.4)缓冲液以中和枸橼酸，5000r/min离心5min，将上清转移至另一无菌Eppendorf管中。将经过筛选的次级噬菌体抗体库和10ml处于对数生长期的大肠杆菌XL1-Blue混合，并在37℃静置30min使表达有特异抗体的噬菌体感染细菌。在37℃剧烈振荡培养30min使被感染的细菌恢复氨苄抗性。加入氨苄青霉素至终浓度为100μg/ml，继续在37℃振荡培养45min。按151的比例加入辅助噬菌体M13K07，在37℃静置30min，使辅助噬菌体感染细菌。感染后继续在37℃振荡培养30min。2800r/min，离心15min，弃去上清。将细菌重悬于25ml含有12μg/ml四环素、100μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml卡那霉素的2YT培养基中，在30℃过夜培养。过夜培养物经3000r/min，离心5min去除细菌。将上清转移至一洁净无菌离心管中，加入1/4体积的PEG/NaCl溶液，混匀后在冰水混合物中孵育2h。在4℃以4000r/min离心30min沉淀噬菌体，离心后弃去上清，沉淀重悬于1ml含1% BSA的PBS缓冲液中，经0.45μm的滤膜过滤除菌后进行下一轮富集。此步骤重复4轮。

单链抗体的小量制备：将经4轮富集的抗体库铺到含有氨苄青霉素和四环素的琼脂培养板上，从培养板上挑选单菌落接种到2ml含12μg/ml四环素、100μg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的2YT培养基中，过夜培养扩增后提取噬粒(phagemid)。取1μl噬粒转化30μl大肠杆菌SF110，加入500μl SOC培养基在37℃孵育1h以恢复氨苄抗性，取100μl接种到25ml含0.1%葡萄糖及100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于30℃摇床中振荡培养(250r/min)至A(吸光度)=0.5，加入IPTG至其终浓度为1mmol/L，转移至25℃摇床中振荡培养过夜(250r/min)。将过夜培养物以3000r/min离心10min，弃去上清，将沉淀重悬于1/100体积预冷(0℃)的TES(0.2mol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA pH8.0, 0.5mol/L Sucrose)缓冲液中并转移至Eppendorf管中，混匀后加入1.5/100体积预冷(0℃)的1/4 TES缓冲液，并振荡混匀，放置于冰水中静置1h。将Eppendorf管放置于高速离心机中以14000r/min离心30min，弃掉沉淀，将上清转移至另一无菌Eppendorf管中，冻存于-20℃备用。

免疫组织化学染色分析：将冰冻组织块固定在载物台上，连续切6μm的冰冻切片。切出的切片立即转移至预先用明胶包被的玻片上，并在室温下干燥。干燥后的切片放入丙酮中，在室温下固定5min。固定后的切片放在室温下自然风干。切片干燥后放入PBS/Tween缓冲液中浸泡5min。将解冻的单链抗体加到切片上，和组织切片在室温下孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未能和组织结合的单链抗体。加入二抗荧光标记的小鼠单克隆抗体9E10(FITC-9E10)，在室温下黑暗处孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未能结合单链抗体的单克隆抗体。用PBS缓冲液冲洗切片1次，最后用滴有抗荧光淬灭剂(Fenyleen diamine)的盖玻片封片，并在荧光显微镜下检查染色类型。

流式细胞计(FACS)染色分析：各种类型的细胞系在培养瓶中生长到合适的密度以后，用PBS冲洗1遍，加入含有0.1%EDTA的PBS并在37℃孵箱中孵育10min使细胞松散。收集细胞，重悬在FACS缓冲液中并调整细胞浓度为2×10⁶/ml。在96孔板中每孔加入10⁵细胞，并加入单链抗体在冰上孵育60min。用FACS缓冲液冲洗细胞2次，加入FITC标记的二抗9E10(FITC-9E10)及碘化丙啶，在冰上孵育30min。用FACS缓冲液冲洗细胞3次，将细胞重悬于100μl FACS缓冲液中。样品的测量在FACScan流式细胞计上进行。

荧光双标记染色：取干燥的冰冻切片放入丙酮中固定，重新浸泡在PBS/Tween缓冲液中。分别在不同的切片上加入大鼠抗小鼠髓质上皮细胞单克隆抗体ER-TR5及仓鼠抗小鼠树突状细胞单克隆抗体N418，在室温下孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未结合的游离单克隆抗体。分别加入FITC标记的兔抗大鼠Ig单克隆抗体及FITC标记羊抗仓鼠Ig单克隆抗体，于室温下在黑暗处孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未结合的游离荧光抗体。在切片上加入单链抗体，于室温下黑暗处孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未结合的游离单链抗体。加入生物素标记的9E10单克隆抗体Bio-9E10，于室温下黑暗处孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未结合的游离单克隆抗体。加入Texas Red 偶联的亲和素，于室温下<