【 摘要 】目的为降低鼠源性抗体对人体的免疫原性并降低其分子量，进行了人活化血小板单克隆抗体SZ-51单链抗体(ScFv)的基因构建及表达，希望摸索出一套稳定、高效表达SZ-51 ScFv的方法。 方法同时构建了两种不同的SZ-51 ScFv表达载体pHEN1-51 ScFv及pET20b-51 ScFv，并分别导入大肠杆菌HB2151及BL21(DE3)plys 中进行表达，同时对它们的表达特性进行了比较。 结果pHEN1-51 ScFv在HB2151中经IPTG诱导后，SZ-51 ScFv以可溶性形式分泌至细菌培养上清中。pET20b-51 ScFv在BL21(DE3)plys中经IPTG诱导后，SZ-51 ScFv以可溶性与不溶性的包涵体两种形式存在，其表达量占菌体总蛋白的20%。经Western blot证明两种体系表达产物均维持了亲本抗体与活化血小板特异性结合的能力。 结论pET20b表达体系对于SZ-51 ScFv而言是一种稳定、高效的表达体系。但其包涵体部分的变复性条件仍需进一步探讨。

The expression of single chain Fv fragment of monoclonal antibody against activated platelets in E.coli

XIA Xiaobo, WAN Haiying, WANG Bin

（Jiangsu Institute of Hematology, Thrombosis and Haemostasis Research Unit, First Affiliated Hospital, Suzhou Medical College, Suzhou 215007, P.R.China）

【 Abstract 】ObjectiveTo reduce immunogenicity and molecular weight of a monoclonal antibody specific for activated human platelet and to express single chain Fv fragment (ScFv) in E.coli. MethodsTwo expression vectors of SZ-51 ScFv, pHEN1-51 ScFv and pET20b-51 ScFv, were constructed and transformed into E.coli strain HB2151 and BL21(DE3) plys, respectively. The expressed recombinant proteins were analysed. ResultsInduced by IPTG, HB2151 secreted soluble SZ-51 ScFv to the cultured supernatant. The BL21 (DE3) plys expressed the SZ-51 ScFv the soluble recombinant protein and insoluble recombinant protein in inclusion bodies and constituted 20% of the total cell protein. Western blot analysis showed that the SZ-51 ScFv obtained from two strains of E.coli maintained the binding activity to activated human platelet as their parent ones. ConclusionThe results showed that the pET20b expression system is stable and efficient for expressing SZ-51 ScFv. However, the denaturation and protein refolding of the SZ-51 ScFv expressed in inclusion bodies need to be studied further.

【 Subject words 】Monoclonal antibody; Single-chain Fv; Activated human platelet

SZ-51是我室于1989年通过杂交瘤技术制备的一株抗人活化血小板GMP-140单克隆抗体，已通过动物体内外实验证实具有良好的血栓导向能力，可作为导向溶栓和导向血栓显像的优良导向载体^〔1〕。为降低其鼠源性抗体对人体的免疫原性并降低其分子量，以适应临床使用的需要，有必要通过基因工程的手段对其进行“人源化”改造或表达抗体各类功能片段。为此目的，我室于1995年用RT-PCR技术从SZ-51杂交瘤细胞中扩增出其重、轻链可变区基因片段，分别克隆至pUC18中并进行了测序^〔2〕。本文在此基础上进行了SZ-51单链抗体不同表达载体的构建工作，并对在不同大肠杆菌表达体系中表达SZ-51单链抗体进行了比较，摸索出了一套稳定、高效表达SZ-51 ScFv的方法。

材料与方法

1.实验材料

引物：

P1：5′-CAACTGCAGGAGTCTGGACCTGAG-3′

PstⅠ

P2：5′-GACGGTGACCGAGGTTCCCTGACC-3′

BstEⅡ

P3：5′-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3′

SacⅠ

P4：5′-GATCTCGAGCTTGGTTCCTCC-3′

XhoⅠ

P5：5′-TTCTGCGGCCGCCCGTTTGATCTCGAGCTT-3′

NotⅠ

P6：5′-AAGGATCCACTGCAGGAGTCTGGA-3′

BamHⅠPstⅠ

P7：5′-CGCCAAGCTTATTCAGATCCTCTTCTGAG-3′

HindⅢ

以上引物均由中国科学院上海细胞研究所基因室合成。

质粒及菌株：质粒pUC18-51V_H及pUC18-51Vκ为本室构建保存。质粒pSW1-ScFv、pHEN1及菌株HB2151由英国剑桥MRC实验室Winter博士惠赠。菌株TG1为本室保存。质粒pET20b及菌株BL21(DE3)plys购自Novagen公司。

试剂：限制性内切酶为Boehringer Mannheim产品；T4 DNA连接酶为BioLabs产品；PCR扩增试剂盒为PE Cetus产品；α-［³²P］-dATP购自北京福瑞公司；随机引物标记试剂盒为Amersham产品；IPTG为 Promega产品；His-bind-Resin亲和层析柱购自Novagen公司；¹²⁵I为北京401所产品；丙烯酰胺与双丙烯酰胺为Sigma产品；羊抗鼠IgG购自上海华美生物工程公司；鼠源抗Myc单抗购自天津血液学研究所。

2.方法

PCR产物的克隆测序：PCR参照Saiki等^〔3〕描述的方法进行。PCR扩增产物以等体积氯仿/异戊醇(24/1)抽提一次，2.5倍体积乙醇沉淀后，经琼脂糖低熔点凝胶电泳分离纯化扩增基因片段，经Klenow DNA多聚酶补平或经限制性内切酶消化后，克隆到经相应处理的pUC18空载体中。空载体与插入片段以1∶10摩尔数比混合，在T4 DNA连接酶催化下于16℃反应过夜，转化TG1感受态细菌后抽提质粒DNA，经酶切鉴定阳性质粒。通过Sanger双脱氧末端终止法进行DNA序列测定。

表达载体的构建

(1) pSW1-51 ScFv的构建：通过P1与P2，P3与P4两对引物分别从pUC18-51V_H及pUC18-51Vκ中扩增出SZ-51单抗V_H与Vκ基因并引入相应酶切位点。SZ-51 V_H用PstⅠ和BstEⅡ双酶切；SZ-51Vκ用SacⅠ和XhoⅠ双酶切，相继与同样酶切处理的包含ScFv基因的pSW1-ScFv空载体连接，转化TG1感受态细菌后抽提质粒DNA，经酶切鉴定筛选获得阳性克隆pSW1-51 ScFv。应用随机引物法将α-［³²P］-dCTP标记于SZ-51重链和轻链可变区基因片段上，并以此为探针经Slot-blot杂交验证阳性克隆。

(2) 表达载体pHEN1-51 ScFv的构建：以pSW1-51 ScFv为模板，以P1与P5为引物扩增SZ-51 ScFv片段并引入相应酶切位点。与表达质粒pHEN1经PstⅠ和NotⅠ双酶切后，进行连接并转化感受态细菌HB2151，经酶切鉴定筛选获得阳性克隆pHEN1-51 ScFv，再经Slot-blot方法验证阳性重组子。pHEN1载体中具有一段Myc蛋白基因，将为表达产物的检测提供方便。

(3) 表达载体pET20b-51 ScFv的构建：以pSW1-51 ScFv为模板，以P6与P7为引物扩增SZ-51 ScFv片段并引入相应酶切位点。将纯化的SZ-51 ScFv单链基因片段用BamHⅠ、HindⅢ双酶切后克隆至经相同酶切处理的pET20b空载体中，转化感受态细菌TG1后抽提质粒DNA，并经酶切鉴定筛选获得阳性克隆pET20b-51 ScFv。再经Slot-blot方法验证阳性重组子。用阳性质粒转化感受态细菌BL21(DE3)plys，经同样酶切鉴定及Slot blot筛选获得阳性克隆，并按Novagen公司说明书进行质粒稳定性试验。pET20b载体中含有一段6xHis-tag，为表达产物的纯化提供了方便。

可溶性51 ScFv片段在大肠杆菌HB2151中的表达^〔4〕：将质粒pHEN1-51 ScFv重组体转化的HB2151单个菌落接种至2×TY培养液(内含100μg/ml氨苄青霉素，1%葡萄糖)中，37℃振摇，待A550=0.5～1.0时，收集细菌，以50mmol/L NaCl洗涤1次，细菌沉淀悬浮于2ml 2×TY(内含100μg/ml氨苄青霉素，0.8mmol/L IPTG)中，37℃振摇16～24h。取上清进行SDS-PAGE及Western blot直接测定表达抗体蛋白及抗体活性。

51 ScFv片段在大肠杆菌BL21(DE3)plys中的表达： 将表达载体pET20b-51 ScFv重组体转化的BL21(DE3)plys单个菌落接种至2×TY培养液(含100μg/ml氨苄青霉素，34μg/ml氯霉素及1%葡萄糖)中，37℃振摇，待A600=0.6时，收集细菌，将细菌重悬于2ml培养基中，按1∶20接种至50ml含相同浓度抗生素的LB中，37℃振摇，待A600=0.6时，加IPTG（0.7mmol/L）诱导，30℃振摇2.5h，在4℃下5000r/min离心10min收获细菌。以20mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl洗涤液洗1次，加1/10（v/v）溶菌液（20mmol Tris-HCl，含1% Triton X-100，250μmol/L PMSF以及100μg/ml溶菌酶），30℃放置15min，然后在冰上超声处理（输出功率80%）10s，停10s，反复3～5次，至细胞悬液不再粘稠。在4℃ 2000×g离心20min，分别收集细胞上清及沉淀。沉淀再结合缓冲液（20mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑）洗涤1次，而后，重悬于上述结合缓冲液（另含6mol/L尿素）中，冰中搅拌溶解1h，4℃，12000×g离心20min，收集上清，经0.45mm滤膜过滤，然后上His-Bind Resin亲和层析柱纯化，纯化产物分别在400ml含有下列成分的50mmol/L Tris-HCl pH8.5缓冲液透析：（1）4mol/L尿素；（2）2mol/L尿素，1mmol/L氧化型谷胱甘肽；（3）2mol/L尿素，0.5mol/L还原型谷胱甘