【 摘要 】目的研究伤寒杆菌耐药质粒pR_ST98在不同种属肠道杆菌间(大肠杆菌、伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌及痢疾杆菌)互相接合传递的规律及表达。 方法 以3株携带不相容性C群（IncC）pR_ST98的伤寒杆菌作供体，用传统及改良的两种接合转移试验方法，研究其在肠道杆菌间的传递及耐药标志的表达，并用核酸内切酶对供体菌及受体接合子的R质粒进行分析。 结果pR_ST98能在4种肠道杆菌间传递；但在不同种属中R质粒接合难易程度不同；同一R质粒在不同宿主菌中耐药标志的表达亦有差异。 结论质粒的可传递性给阻断耐药性的传播和疾病的防治带来很大困难，大肠杆菌在一定条件下可将耐药质粒传递给伤寒杆菌等肠道致病菌。正常菌群中庞大的耐药基因库是致病性耐药菌株流行的潜在危险；同一质粒在不同宿主菌中耐药标志的差异显示出耐药质粒表达的多样性和复杂性。

The conjugational transfer and antibiotic resistance expression of S.typhi R plasmid (pR_ST98) in different enteric bacilli

HUANG Rui

（Department of Microbiology, Suzhou Medical College, Suzhou 215007,P.R.China）

QIN Ailan, WEN Yumei

【 Abstract 】ObjectiveTo study the conjugational transfer and antibiotic resistance expression of pR_ST98 in different enteric bacilli(including E.coli, S.typhi, S.typhimurium and S.flexneri). MethodsThe antimicrobial resistance of 13 strains of enteric bacilli were tested against 13 different antimicrobial agents by means of Kirby-Bauer disc agar diffusion. Their plasmid profiles were also determined. In the conjugation test, 3 strains of clinical isolated multiresistant S.typhi harbouring pR_ST98 were tested for the ability to transfer their R plasmids to a plasmid-free laboratory strain of E.coli K₁₂W₁₄₈₅Rif^r. Thereafter, E.coli K₁₂W₁₄₈₅ receiving pR_ST98 were used as dornors, while the sensitive and resistant strains of E.coli, S.typhi, S.typhimurium and S.flexneri as recipients for conjugation. Antibiotic susceptibility, plasmid and restriction enzyme analysis of the donors and transconjugants were used for confirmation of the results. ResultsThe pR_ST98 could transfer among E.coli, S.typhi, S.typhimurium and S.flexneri, but in different genera the conjugal transfer conditions were different and the resistant markers coded by the same pR_ST98 in different strains varied. ConclusionspR_ST98 could be transferred from S.typhi to E.coli and then to sensitive and resistant pathogenic bacilli. It is very difficult to block and prevent the spreading of antimicrobial resistance. The varied expression of pR_ST98 in different strains demonstrated the diversity and complexity of the R plasmid.

【 Subject words 】R plasmid; Enteric bacilli; Conjugational transfer; Antibiotic resistance expression

80年代末至90年代初，我国由南向北在贵州、湖北、河南、浙江、江苏、安徽等13省市先后发生了多重耐药伤寒的严重流行。我们曾对1987～1992年苏州地区分离的591株伤寒杆菌（S.typhi,ST）进行了耐药监测及研究，质粒电泳证明，其多重耐药性由一相对分子质量为98.6×10⁶(155kb)的大质粒所介导，称之pR_ST98(图1)，而敏感菌株则无质粒检出。经质粒不相容性分群，证实该R质粒属不相容性C群（IncC）^〔1，2〕。1991年起国内伤寒杆菌恢复了对抗生素的敏感性，该质粒亦随之从菌体中消失^〔3〕。然而，伤寒杆菌由于获得新的耐药质粒近几年来在世界上其它国家再次发生流行^〔4，5〕。为研究pR_ST98能否转移至其它肠道菌及这一耐药质粒在不同种属肠道杆菌中的表达，我们选择大肠杆菌(E.coli)、伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌(S.typhimurium, STM)及痢疾杆菌(S.flexneri, S.f)进行接合传递和耐药标志表达的研究。

材料与方法

菌株：接合转移供体菌为临床分离的3株携带IncC群pR_ST98的耐药伤寒杆菌ST_1～3；受体菌(1)：E.coli K₁₂W₁₄₈₅(F^-)Rif^r，该菌不含任何质粒，系经实验室诱变的仅在染色体上有利福平耐药基因的无性菌毛F^-雌性菌；(2)：1株敏感伤寒杆菌ST₄、3株大肠杆菌E.coli_1～3、3株鼠伤寒杆菌STM_1～3及3株福氏痢疾杆菌S.f_1～3。以上菌株除E.coli K₁₂W₁₄₈₅外均从苏州医学院附属一院检验科收集。药敏试验质控菌大肠杆菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923和铜绿色假单胞菌ATCC27853；含标准相对分子质量质粒菌株E.coliV₅₁₇(35.8,4.8,3.7,3.4,2.6,2.0,1.8,1.4)×10⁶和S.flexneri₂₄₅₇₀(140, 105, 2.6, 2.0)×10⁶及E.coli K₁₂W₁₄₈₅均由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所惠赠。

图1临床分离的伤寒杆菌耐药质粒pR_ST98琼脂糖凝胶电泳图谱

Fig 1. Agarose gel electrophoresis of pR_ST98 from clinical isolated multiresistant S.typhi

A-F. multiresistant S.typhi

G. antibiotic sensitive S.typhi

H. S.flexneri₂₄₅₇₀, plasmid size marker〔(140,105,2.6,2.0)×10⁶〕

I. E.coli V₅₁₇, plasmid size marker〔(35.8,4.8,3.7,3.4,2.6,2.0,1.8,1.4)×10⁶〕

培养基：普通培养基：用于细菌传代与培养。LB培养基：用于细菌活化和质粒接合转移试验中供、受体菌的混合培养。水解酪蛋白琼脂（Mueller-Hinton）培养基：用于药敏试验。中国蓝和SS琼脂培养基：加入利福平等相应抗生素，用于接合转移试验的选择性培养基。

药物与试剂：除利福平外（由苏州第三制药厂提供），氯霉素、卡那霉素、氨苄西林、四环素和诺氟沙星均为标准品，购自中国药品生物制品检定所。抗生素药敏纸片：除利福平外（大连生化试剂厂），均系上海医化所产品。

药敏试验：采用Kirby-Bauer纸片扩散法，结果判断根据NCCLS1999。选用13种药物：利福平(Rif)，氯霉素(Cm)，复方磺胺(Cos)，链霉素(Sm)，庆大霉素(Gm)，卡那霉素(Km)、阿米卡星(Akn)，头孢噻吩(Cp)，新霉素(Nm)，四环素(Tc)，氨苄西林(Ap)，羧苄西林(Cb)，诺氟沙星(Nf)。试验时用质控菌与待测菌平行测定结果，实行质量控制。

质粒的接合转移试验：方法一：伤寒杆菌pR_ST98向E.coli K₁₂W₁₄₈₅的接合转移主要按文献〔6〕进行。方法二：接受了pR_ST98的E.coli K₁₂W₁₄₈₅作供体，向其它敏感及耐药的肠道菌接合时，按文献〔7〕改良进行。供、受体菌分别接种于4ml LB肉汤，37℃过夜。各吸0.1ml加入4ml LB肉汤，37℃，4h混合后4000r/min离心5min，弃上清，菌体用1ml生理盐水混匀，吸取0.1ml涂布于水解酪蛋白琼脂37℃过夜。用2ml生理盐水洗下菌苔，经10^-2～10^-3稀释后，吸取0.1ml菌液均匀涂布于含药的SS琼脂。抗生素剂量分别为Rif(100μg/ml)、Cm(20μg/ml)、Km(25μg/ml)、Tc(25μg/ml)、Ap(25μg/ml)和Nf(25μg/ml)。取无色透明菌落在相同选择琼脂上传代1次，再于普通琼脂上活化后，进行药敏试验并做质粒电泳检测和核酸内切酶分析。

质粒提取及质粒电泳检测：按Takahashi法^〔8〕进行。

结果

1.药敏试验及质粒DNA检测：13株肠道杆菌耐药谱见表1。3株多重耐药伤寒杆菌ST_1～3均含1个98.6×10⁶质粒，其余耐药菌株都携带1～3个质粒（图2）。敏感伤寒杆菌ST₄、大肠杆菌E.coli₃、鼠伤寒杆菌STM₃及痢疾杆菌S.f₃不含质粒。

图2接合传递试验部分供、受体菌的质粒图谱

Fig 2. Plasmid profile of partial donors and recipients

A. ST₁; B. ST₂; C. ST₃; D. E.coli₁; E. E.coli₂; F. STM₁; G. STM₂; H. Sf₁; I. Sf₂2.pR_ST98由伤寒杆菌向大肠杆菌的接合传递：以Rif和Cm作为选择抗生