【 摘要 】目的建立一种测定噬菌体抗体相对亲和力的方法。 方法参照硫氰酸盐洗脱法测定完整抗体分子和Fab段相对亲和力的方法，在ELISA实验中以酶标抗M13为二抗检测5个单克隆噬菌体抗体的相对亲和力，并与可溶性Fab段的相对亲和力进行比较。 结果噬菌体抗体可以耐受硫氰酸盐的洗脱，用硫氰酸盐洗脱法测定5个噬菌体抗体所得亲和力排序与测定其相应可溶性抗体分子片段所得结果一致。 结论硫氰酸盐洗脱法可用于噬菌体抗体相对亲和力的测定。

Relative affinity measurement of phage antibodies by ELISA using thiocyanate elution

WANG Gang, WANG Yan

（Navy General Hospital, Beijing 100037, P. R. China）

【 Abstract 】ObjectiveTo establish a method for the measurement of relative affinity of phage antibodies. MethodsThe relative affinities of 5 phage antibodies were measured by ELISA using thiocyanate elution. A HRP-conjugated anti-M13 was used as secondary antibody, and the affinity of the phage antibodies were compared with that of the Fab fragments. ResultsPhage antibodies were tolerant to thiocyanate elution. The relative affinity of 5 phage antibodies measured by ELISA using thiocyanate elution coincided with that of their corresponding Fab fragments. ConclusionThe relative affinity of phage antibodies could be determined by ELISA using thiocyanate.

【 Subject words 】Antibody affinity; Phage antibody; Thiocyanate elution

亲和力是反映抗体特性的一个重要指标，也是抗体研究中经常需要测定的参数，在抗体的筛选、鉴定乃至其功能和应用研究等方面都涉及到亲和力的问题。目前噬菌体抗体库技术已得到越来越广泛的应用，为测定所获抗体的亲和力，需进一步表达出可溶性抗体分子片段，尚无一种简便可行的直接衡量噬菌体抗体亲和力的方法。为此，我们参照测定完整抗体分子和Fab段相对亲和力所用的硫氰酸盐洗脱法，尝试用类似的方法检测噬菌体抗体的相对亲和力。

材料与方法

抗体、抗原和主要试剂：选择本室从噬菌体抗体库中筛选获得的5个单克隆抗体作为检测对象，包括3株抗角蛋白抗体AK1、AK2、AK3和2株抗HBsAg抗体HB1、HB2，这5株抗体的噬菌体抗体表达载体和可溶性Fab表达载体均为本室构建^〔1-3〕。人表皮角蛋白抗原由第四军医大学西京医院皮肤科制备；重组HBsAg购自卫生部北京生物制品研究所；硫氰酸铵(NH₄SCN，分析纯)系成都化学试剂厂产品；HRP-羊抗人Fab为Pierce产品，HRP-抗M13购自Pharmacia Biotech；大肠杆菌菌株TG1、XL1-Blue和辅助噬菌体VCSM13为本室保存。

噬菌体抗体的制备：将-70℃冻存的各种噬菌体抗体菌株铺TYE-Amp琼脂平板，37℃培养过夜；从中挑取单集落在1.5ml含Amp和葡萄糖的2×YT中37℃振荡培养8h，取出100μl到10ml含Amp的2×YT中继续培养1h后加入30μl VCSM13(2×10¹¹PFU/ml)超感染，37℃振荡培养过夜，菌液离心收上清即为噬菌体抗体。取1μl噬菌体抗体上清适当稀释后感染半对数期生长的TG1菌，铺TYE-Amp琼脂平板计数菌落以滴定噬菌体抗体的滴度，并用培养液将5种噬菌体抗体的滴度均调整至1×10¹¹CFU/ml，存4℃备用。

可溶性Fab的制备：各种可溶性Fab抗体冻存菌株的培养方法同噬菌体抗体制备，诱导表达时不用辅助病毒而加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，Promega)至1mmol/L，37℃振荡培养过夜后离心收上清即为可溶性Fab。用ELISA的方法测定各个克隆Fab表达量，见文献〔1〕。并均用培养液调整至100ng/ml，存4℃备用。

相对亲和力测定：参照文献〔4，5〕的方法进行。抗原以0.05mol/L的碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释至1μg/ml包被酶联板，50μl/孔4℃过夜；次日弃包被液，加1%BSA 300μl/孔，37℃封闭1h；弃封闭液，加待测噬菌体抗体或可溶性Fab 50μl/孔，37℃孵育2h；用TPBS洗3次后进行硫氰酸盐洗脱处理：每孔加NH₄SCN溶液60μl，浓度依次为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0mol/L，室温静置15min；用TPBS洗3次，加相应的酶标二抗（HRP-抗M13或HRP-羊抗人Fab）50μl/孔，37℃孵育2h；TPBS洗涤3次，OPD底物显色并读取A490值。经硫氰酸盐洗脱后每种抗体与抗原结合的A490值下降至原来的50%时其NH₄SCN浓度即为该抗体的亲和力指数，以mol/L表示，通过比较亲和力指数衡量亲和力的高低。

结果

1.不同浓度NH₄SCN对噬菌体ELISA的影响：为了了解NH₄SCN与结合于固相的噬菌体作用后是否会损坏噬菌体颗粒而影响ELISA反应的结果，我们将VCSM13（2×10¹¹PFU/ml）以50μl/孔包被酶联板，以1.0mol/L～6.0 mol/L的NH₄SCN室温作用15min(空白对照组用蒸馏水)，再以TPBS(含0.05%Tween20的PBS)洗3次，加1∶2000的HRP-抗M13 37℃孵育2h后OPD底物显色读取A490值。发现NH₄SCN处理不影响噬菌体的ELISA检测（图1）。

图1不同浓度NH₄SCN作用于噬菌体对ELISA反应的影响

Fig 1. Effect of NH₄SCN treatment on ELISA of phage

2.抗角蛋白抗体的相对亲和力测定：分别用NH₄SCN洗脱法测定了抗角蛋白抗体AK1、AK2、AK3的噬菌体抗体和可溶性Fab段的相对亲和力，结果见图2和图3。它们的相对亲和力排序一致，噬菌体抗体的亲和力指数分别为1.0、1.85、2.13mol/L；可溶性Fab的亲和力指数分别为0.42、1.35、1.46mol/L。

图2抗角蛋白噬菌体抗体的相对亲和力

Fig 2. Relative affinities of anti-keratin phage antibodies

图3抗角蛋白可溶性Fab的相对亲和力

Fig 3. Relative affinities of anti-keratin Fabs

3.抗HBsAg抗体相对亲和力的测定：用相同方法测定了2株抗HBsAg克隆HB1和HB2的噬菌体抗体和可溶性Fab段的相对亲和力，二者的亲和力排序一致（图4、图5），噬菌体抗体的亲和力指数分别为2.5mol/L和2.8mol/L；可溶性Fab的亲和力指数分别为2.4mol/L和2.6mol/L。

图4抗HBsAg噬菌体抗体的相对亲和力

Fig 4. Relative affinities of anti-HBsAg phage antibodies

讨论

噬菌体抗体库技术的出现极大地促进了各种有实用价值的抗体的研制。对抗体亲和力的及时评价在抗体的筛选中很重要，尤其是用抗体库技术对抗体亲和力进行改良时，需要简单易行的方法及时评价所获噬菌体抗体的亲和力，以从众多的克隆中选择出性能较优者。迄今，这种评价需进一步将所获噬菌体抗体基因表达为可溶性抗体分子片段，测定其亲和力进行评估，此过程费时费力，如所研制的是单链抗体时，还可能因缺乏适当的二抗而无法用ELISA检测。Pullen等^〔4〕曾在1986年报道了用硫氰酸盐洗脱法测定抗体的相对亲和力，其后Macdonald等^〔5〕和McCloskey等^〔6〕证实了这种方法的可行性。此方法利用不同浓度的硫氰酸盐对抗体抗原复合体有不同的洗脱能力来测定抗体之间的亲和力差别。鉴于这种方法简单易行，我们尝试了将其应用于噬菌体抗体相对亲和力的测定。在进行噬菌体抗体的ELISA时，一般用HRP-M13作为二抗，其结合的对象是噬菌体病毒的外壳蛋白，我们首先证实了硫氰酸铵洗脱未破坏噬菌体颗粒的完整性，不干扰噬菌体的ELISA检测。然后尝试用硫氰酸盐洗脱法直接对噬菌体抗体进行相对亲和力测定。结果发现所测定5个克隆的噬菌体抗体亲和力排序与来自同一克隆的可溶性Fab测定后的亲和力排序完全一致，说明这一方法可以较为可靠地反映噬菌体抗体的亲和力水平并用于比较不同抗体间相对亲和力的差异。本工作发现，在测定相对亲和力时，噬菌体抗体亲和力指数略高于可溶性Fab，其原因尚不清楚，不知是否与噬菌体抗体的检测所用的二抗为HRP-抗M13有关，抗M13可与病毒外壳为数众多的外壳蛋白结合，其数量达数千之巨，有较大的放大效应。这种放大效应如果与A值不成线形关系则有可能使亲和力指数升高。但这并不影响用硫氰酸盐洗脱法测定噬菌体抗体的相对亲和力。

图5抗HBsAg可溶性Fab的相对<