【 摘要 】目的从噬菌体抗体库中克隆到1株V_H第3骨架区中含有异常序列的抗HBs人Fab基因，探讨该V_H基因中异常序列对抗体活性的影响。 方法采用重叠PCR方法去除了这段异常序列，构建表达载体，转化大肠杆菌表达出抗HBsAg噬菌体抗体和可溶性Fab，测定了它们与抗原的结合活性。 结果与原抗体比较，改造后的抗体与抗原的结合活性明显下降，分子模建提示这段异常序列对V_H CDR1和CDR2的部分氨基酸残基的位置有一些影响，测定改造前Fab的亲和力约为0.55×10⁹mol/L，改造后Fab因抗原结合活性过低，无法检测其亲和力。 结论提示这段异常序列在体内可能存在于该V_H之中。

A stretch of extra-sequence in an anti-HBs V_H gene is indispensable for the antibody activity

CHEN Xiaohui, ZHU Yingchun, WANG Yuxiao

（Navy General Hospital, Beijing 100037, P. R. China）

【 Abstract 】ObjectivePreviously we cloned a human anti-HBs Fab, the V_H of which contained a stretch of extra-sequence. In this work we investigated the effect of the extra-sequence on the activity of the anti-HBs Fab. MethodsFollowing removal of the extra-sequence by overlap PCR, the modified Fab gene was expressed in E.coli, and its Ag binding activity tested and compared with the original Fab. ResultsThe modified Fab showed drastically decreased Ag binding activity. Molecular modeling demonstrated changes in some residues in V_H CDR1 and CDR2. The associate constant of the original Fab is about 0.55×10⁹mol/L, while the ELISA signal of the modified Fab was too weak to determine the affinity. ConclusionThe V_H containing extra-sequence may exist in vivo.

【 Subject words 】Antibody variable region; HBsAg; Molecular structure

抗体分子的轻重链由可变区和恒定区等数个结构域组成，可变区与恒定区氨基酸残基数均非常保守，是抗体功能活性的重要基础。我们曾经从乙肝表面抗原疫苗免疫的志愿者获取淋巴细胞构建了人源性噬菌体抗体库，并从中克隆到1株抗HBsAg人Fab基因，其V_H在第三骨架区内77～78位氨基酸之间发现7个多出的氨基酸，经对基因数据库检索未能查到其来源^〔1〕。由于免疫球蛋白可变区骨架区的氨基酸序列长度及组成均极为保守，也未见此类现象的报道，因此我们设想这段序列很可能是在抗体库构建及筛选过程中所插入。考虑到此特异性抗体基因来自经抗原免疫的人体，抗原的结合能力在体内形成后插入的片段有可能影响其与抗原结合的亲和力。因此我们通过基因改造除去这段序列，改善该抗体与抗原的结合性能。结果发现与我们预期相反，此段序列去除后抗体活性明显下降，现将实验结果报告如下。

材料与方法

质粒、菌株及主要实验材料：含有抗HBsAg人Fab基因的噬菌体抗体表达载体p3HB2和可溶性Fab表达载体p3HB2S(去掉基因Ⅲ的p3HB2)，由本实验室构建^〔1〕。大肠杆菌菌株XL1-Blue及辅助病毒VCSM13购自美国Stratagene公司。

引物：去除抗HBsAg人Fab的V_H中异常序列的引物HB2-1为5′-ACATCCAGGAGCACAGCCTACATGG

AATTG，此引物前16个碱基与异常序列上游的序列互补，后14个碱基与异常序列下游的碱基互补。HB2-2为5′-CAATTCCATGTAGGCTGTGCTCCTGGATGT，

此引物前14个碱基与异常序列下游的序列互补，后16个碱基与异常序列上游的序列互补，是 HB2-1互补序列。重链Fd段5′端引物为5′-CAGTCCATATGAAATAACTATTGCCTAC，3′端引物为GCATGTACTAG

TTTTGTCACAAGA，下划线处为SpeI识别位点。V_H 5′端引物为SAGGTGCAGCTCGAGSAGTCTGGG，3′端引物为GCCCTTGGTACTAGTTGARGAGACRGTGACC。

主要试剂：提取质粒DNA的Wizard Plus Minipreps DNA Purification System，PCR所用的dNTP等试剂，各种分子生物学试验用的工具酶，以及细菌培养用的试剂等，购自美国Promega公司。羊抗人Fab和HRP-羊抗人IgG购自美国Sigma公司；HRP-羊抗人Fab购自美国Pierce公司；HRP-羊抗M13噬菌体购自瑞典Pharmacia公司。重组HBsAg由卫生部长春生物制品研究所惠赠。

PCR去除V_H中的异常序列（见图1）：以质粒为模板，分别以重链Fd段5′端引物和HB2-2为引物扩增出V_H中异常序列上游的部分，用HB2-1和重链Fd段3′端引物扩增出异常序列下游的序列，经琼脂糖电泳及电洗脱回收后，通过重叠PCR，以所获的2个片段互为模板与引物，先扩增7个循环，再加入扩增Fd的5′和3′端的引物，继续扩增30个循环。电泳分离±0.7kb的条带，电洗脱回收，将其重组到p3HB2中替换未经改造的Fd基因，得到噬菌体抗体表达载体p3HB2M噬菌体抗体的制备及滴度测定：挑取含有噬菌体抗体表达载体的XL1-Blue菌单集落，接种于LB液中(含Amp、葡萄糖)，37℃ 培养过夜。次日取30μl加入SB(含Amp)1.5ml，37℃培养至A600=0.3～0.4，加入辅助病毒VCSM13 30μl，28℃培养过夜。离心收集上清，即为噬菌体抗体。

图1PCR法对V_H改造示意图

Fig 1. Schematic diagram for the modification of V_H gene with PCR

稀释噬菌体抗体(10^-7、10^-8、10^-9、10^-10)，分别与新鲜培养的XL1-Blue菌液混合，37℃ 15min，铺Amp-LB平板，37℃培养过夜，次日以菌落数计算噬菌体Ab的滴度(CFU)。

噬菌体抗体结合活性的测定：用包被液稀释HBsAg至0.9μg/ml，包被ELISA板，4℃ 过夜，用1%BSA-PBS封闭后，加入稀释成相同滴度的噬菌体抗体培养上清，37℃ 1h；洗5次，加HRP-羊抗M13，37℃ 1h；同上洗涤后以OPD显色。测定A490值。

可溶性Fab载体的构建及表达：用NheⅠ酶切质粒p3HB2M，以除去外壳蛋白Ⅲ基因，自身连接后，得到可溶性表达载体p3HB2MS。将含有可溶性Fab表达载体的XL1-Blue菌接种于SB液(含Amp)，37℃培养A600=0.5，加入IPTG至1mmol/L，28℃诱导过夜。离心收集上清，即为可溶性Fab。

可溶性Fab的定量和结合活性的测定

Fab定量：用羊抗人Fab包被ELISA板，1% BSA-PBS封闭后，加入可溶性Fab培养上清和不同稀释度的人IgG标准品，37℃ 1h，洗涤3次，加入HRP-羊抗人Fab，37℃ 1h，同上洗涤后加入OPD显色，测定A490值。

Fab段活性检测：用HBsAg 0.9μg/ml包被ELISA板，1% BSA封闭后加入稀释至同一浓度的可溶性Fab，其余步骤同上。

抗HBsAg Fab的亲和力测定：采用非竞争性酶免疫法^〔2〕测定亲和力，分别用每毫升含有2.6μg、1.3μg、0.65μg和0.325μg的HBsAg包被ELISA板，将可溶性Fab从15mmol/L起倍比稀释后加样，以HRP-羊抗人Fab和OPD进行显色反应，测定A490值。按公式：K=n-1÷n(Ab′-［Ab］)计算亲和常数，其中［Ab′］为当HBsAg包被浓度为［Ag′］时得到的A₅₀(即最大值的50%)时的抗体浓度；［Ab］为：当HBsAg包被浓度为［Ag］时得到的A₅₀时的抗体浓度。n则等于［Ag］÷［Ag′］。

V_H的同源模建：使用工作软件InsightⅡ（MSI/BIOSYM）的Homology模块，通过Databases 菜单下Run_Fasta命令找到同源参照蛋白，用Alignment菜单下Structure及Multiple_Sequence 命令分别完成结构和序列排列，并参照结构排列结果对序列排列参数进行修正，使结构保守区在序列上尽量保守。然后通过坐标转移得到目的蛋白在结构保守区处的坐标，再通过Loops菜单搜索，生成非保守区的坐标。最后使用Discover模块进行分子力学优化和分子动力学模拟。

结果

1.V_H基因中异常序列的去除：根据V_H中异常序列上游和下游的序列，设计了2个引物，分别PCR先扩增出异常序列上下游2个片段，再利用2个片段末端的互补，用Overlap PCR法扩增去除了异常序列的Fd段(图1)，将其重组到p3HB2载体中形成表达载体p3HB2M，经内切酶分析证实后，进一步测定DNA序列证实21个碱基的异常序列已除去，其余序列与p3HB2相同。如图2所示。

图2去除异常序列前后的V_H序列比较

Fig 2. Sequence alignment of the V_H before and after modificationUnderlined sequences are CDRs

改造前后V_H的立体构象分析：通过分子模建，我们构建了改造前后的V_H的立体构象，如图3所示，异常序列形成了一个襻状结构，并未组成到CDR区域中，但对CDR1和CDR2某些残基的位置有所