【 摘要 】目的找到副粘病毒融合蛋白(F)分子上与血凝素-神经氨酸酶(HN)相互作用的特异性区域，弄清F融合细胞的分子机理。 方法采用基因定点突变法，创造一个酶切位点，得到突变株，然后用基因重组的方法得到各种重组株，并于真核细胞内进行表达，Gimsa染色和指示基因法检测细胞融合功能，荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况。 结果在将各有关F基因片段进行交换之前，创造一个酶切位点时所得突变株的细胞融合功能与野毒株相同；将新城疫病毒(NDV) F和副流感病毒(PIV) F在膜穿入部分和躯干部分交接处交换时，不影响细胞融合功能；进一步将F2进行交换时，也不影响细胞融合功能；而将F的头部进行交换时，则检测不到细胞融合作用，FACS分析表明，F没有达到细胞表面。 结论F分子上与HN相互作用的特异性区域位于膜穿入部分和躯干部分交接处与F1和F2交接处之间，即F1除去膜穿入部分和尾部的剩余部分。

Preliminary identification of an active domain on fusion protein of paramyxoviruses

WANG Zhiyu

（Department of Virology, Shandong Medical University, Ji′nan 250012, P.R.China）

【 Abstract 】ObjectiveTo identify an active domain that interacts with homologous hemagglutinin-neuraminidase(HN) on fusion protein (F) of paramyxoviruses and to find the molecular mechanism of cell fusion. MethodsSite-directed mutagenesis was used to get mutants by creating a new enzyme site and gene recombination was used to get chimeric F proteins. All the wild type, mutant and chimeric F proteins were expressed in eukaryocytes and their fusion functions were assayed by Gimsa staining and fluorescence-activated cell sorter (FACS) analysis. ResultsAll the mutants with a new enzyme site have the same functions as wild type. When the two F genes were recombined at the site between transmembrane and stalk parts, the fusion functions of the chimeric proteins were not affected. Also, this function was not affected when the F′s were exchanged with F2. But fusion activity disappeared when the F′s were exchanged with head parts and F molecules did not reach cell surface as shown by FACS analysis. ConclusionThe specific interaction domain with HN on F protein is in the whole stalk and part of head, i. e. in F1 except transmembrane and tail parts.

【 Subject words 】Paramyxovirus; Fusion protein; Cell fusion; Gene

副粘病毒感染细胞的一个重要步骤是病毒包膜与靶细胞膜发生融合^〔1〕。细胞融合同时也是副粘病毒感染细胞后产生的典型病理特征^〔2〕。这一过程由病毒包膜中的两种糖蛋白共同来完成，即血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase, HN)和融合蛋白(Fusion, F)来完成的^〔3,4〕。HN能吸附于靶细胞，具有血吸附、神经氨酸酶(NA)活性和促进细胞融合作用；而F能破坏靶细胞膜，并引起融合。但F单独表达并不能完成这一过程，需要和同源性HN共同表达才能显示出融合细胞的活性，而和异源性HN共同表达时也不能引起细胞融合，说明F和HN的相互作用具有极强的特异性，它们之间存在着一种相互联系的区域，以产生信息的传递^〔5，6〕。

本工作以新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和副流感病毒(Parainfluenza virus, PIV) 为模型来研究F分子上与HN相互作用的活性位点，因NDV F 和PIV F的同源性高达39%，采用基因定点突变和基因重组的方法，寻找F分子上与HN相互作用的位点，既科学又快速。

材料与方法

材料

（1）病毒：痘苗病毒野毒株和重组株vTF7-3由Moss教授提供，滴度分别为10⁷ PFU/ml和10⁹ PFU/ml，在BHK₂₁细胞上培养传代。

（2）细胞：BHK₂₁细胞由美国AFCC公司提供，用Dubecco Eagle培养液培养传代。实验时每孔接种4×10⁵，16h后使用。

（3）工具酶：各种内切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等均由美国New England生物合成公司提供。

（4）质粒DNA及基因克隆：pBSK⁺质粒DNA和NDV、PIV基因克隆由Iorio博士惠赠。

方法

（1）质粒DNA转染：感染病毒：选生长良好的细胞孔，每孔接种痘苗病毒野毒株25μl，用DMEM培养液稀释，每孔接种0.3ml；另一系列感染痘苗病毒重组株，每6孔板接种量为25μl，即取原液25μl，用DMEM稀释成1.8ml，每孔接种0.3ml。37℃吸附1h后，用DMEM培养液洗涤1次。转染：取待转染的质粒DNA 1μg，与12μl Dope混合，再加入88μl OptiMEM，混匀后加入100μl OptiMEM,室温反应10min。置入相应已感染病毒的细胞孔内，37℃ 5h后，加入BHK₂₁细胞培养液1ml。16h后检测细胞融合情况。

（2）基因定点突变：引物设计：实验用引物由美国Biosynthesis公司合成。引物 1: 5′AATGTCAAACTGGCTAGCACATCTGC 3′; 引物 2: 5′ATTGGCATCAAGCTAGCACCACA 3′; 引物 3: 5′

AAGGAGACAGAAGCGCTTTATAGGTGC 3′; 引物 4: 5′CCCCAGAACAAAGCGCTTCTTTGGAGG 3′; 引物 5: 5′CAGACCCCCATGGTATCATAT 3′; 引物 6: 5′ATGTACATGCAACGGTATCCATGGTAGAATCAATCAACCACCT 3′。各引物中新增加一个酶切位点，用于酶切反应挑选突变株和基因重组。突变反应：以单链含有F基因的质粒DNA为模板，加入上述已磷酸化的引物，加入T4 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶，37℃反应2h后终止反应。

（3）细胞转化：用CaCl₂法将反应物转化大肠杆菌MV1190。

（4）挑选突变株：从转化的细菌菌落中随机挑选若干进一步扩增，提取质粒DNA，酶切反应初步鉴别突变株，然后进行DNA序列分析，进一步确定突变株。

（5）DNA序列分析：采用双脱氧末端法，按照BioRAD公司手册提供的方法进行。

（6）基因重组：NDV F和PIV F由4个部分组成，即头部、躯干部、膜穿入部分和尾部（图1）。按从两端开始交换重组，逐步向内深入的思路，将NDV F 和PIV F需要交换的部分，用双酶切反应法切下，然后进行相互交换（图1），用连接酶连接，转化细胞后，挑选重组株。

图1F蛋白嵌合体构建策略

Fig 1. Strategy for the construction of F chimeras

The division of the F proteins of NDV and hPIV3 into cytoplasmic tail, transmembrane anchor, and putative stalk and globular domains is shown with the amino acid residues that constitute each domain listed. Unique, homologous restriction sites were introduced into the NDV and hPIV3 F genes to make possible the construction of chimeras in which the cytoplasmic tails and transmembrane anchors(NheⅠ), F2(Eco47Ⅲ)or globular domains(NcoⅠ) were exchanged between the two proteins.

（7）DNA表达效率分析：转染后的细胞用间接免疫荧光法检测细胞表面F分子的表达量。第一抗体为F McAb 1a、2b、3c的混合物；第二抗体为羊抗鼠荧光标IgG，用Becton Dickinson流式细胞仪分析细胞表面荧光强度(FACS)。

（8）Gimsa染色：将待测细胞孔的液体吸干，每孔加入1ml甲醇，室温固定3～5min。吸干，干燥后加入1∶20的Gimsa染液，染色15～20min。吸去染液，用蒸馏水洗涤后，于镜下观察、拍照记录细胞融合情况。

（9）细胞融合定量分析：采用指示基因法。第一系列：感染vTF7-3重组痘苗病毒株于BHK₂₁细胞，然后共转染HN和F基因；第二系列：感染痘苗病毒野毒株于BHK₂₁细胞，转染pG1NT7-gal质粒DNA。16h后，用胰酶消化各孔细胞，离心洗涤后，悬浮于0.8ml BHK₂₁细胞培养液。将两系列细胞各0.1ml(10⁵)，混匀后加入96孔平底培养板。37℃培养5h后，每孔加入10μl 10% NP-40，室温摇摆震荡30min。取50μl上清与等量的浓度为16mmol/L的氯酚红-D-半乳糖吡喃糖苷(CPRG)混合，室温反应20min后用Softmax软件支持下的ELISA检测仪，于570nm波长下自动读数。以载体质粒DNA为背景作为阴性对照。

结果

1.NDV F T496A和PIV F S490A突变株的建立及其功能：以引物1和引物2进行定点突变反应，转化MV1190后得到NDV F T496A和PIV F S490A两种突变株，经细胞融合功能观察，与野毒株无差别（图2）。可用于酶切反应，进行基因重组。

图2各种突变株的建立和功能测定

Fig 2. Construc