【 摘要 】目的研究白细胞介素1受体相关激酶1（IRAK-1）和IRAK-2在白细胞介素1（IL-1）诱导核因子-κB（NF-κB）活化中的作用。 方法Lipofectin介导反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸转染HepG2细胞。用逆转录PCR法检测IRAK-1 mRNA和IRAK-2 mRNA表达水平，以夹心ELISA法检测NF-κB的活化。 结果(1) 反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1 mRNA和IRAK-2 mRNA表达。(2) 反义IRAK-1寡核苷酸或反义IRAK-2寡核苷酸部分抑制NF-κB活化，最高抑制率分别为(34.6±0.9)%和(54.5±0.2)%。(3) 反义IRAK-1寡核苷酸与反义IRAK-2寡核苷酸共转染HepG2细胞对NF-κB的抑制作用明显增强，抑制率达(77.5±0.9)%。 结论IRAK-1或IRAK-2调控NF-κB活化，但不能完全激活NF-κB；IRAK-1和IRAK-2协同调控IL-1诱导的NF-κB活化。

Interleukin-1 receptor associated kinase-1 and -2 synergetically activate NF-κB

GUO Fukun, LI Yilei, WU Shuguang

（Institute of Pharmaceutic Sciences, The First Military Medical University, Guangzhou 510515, P.R.China）

【 Abstract 】ObjectiveTo investigate whether interleukin-1 receptor associated kinase-1 (IRAK-1) and IRAK-2 are functionally synergetic or redundant but differentially expressed in interleukin-1 (IL-1)-induced nuclear factor-κB(NF-κB) activation. MethodsPhosphorothioate oligonucleotides (ODN) were designed antisense to sequences of IRAK-1 or IRAK-2. Antisense IRAK-1 ODN or antisense IRAK-2 ODN was delivered by lipofectin encapsulation into cultured HepG2 cells. IRAK-1 mRNA and IRAK-2 mRNA expression were assayed by semiquantitative reverse transcription-PCR. The levels of NF-κB were measured by sandwich ELISA. ResultsAntisense IRAK-1 ODN and antisense IRAK-2 ODN blocked IRAK-1 and IRAK-2 expression, respectively. As a result, antisense IRAK-1 ODN or antisense IRAK-2 ODN inhibited IL-1-induced NF-κB activation in a dose (1-8μg ) and time (5-24 h) dependent fashion. When the cells were treated with antisense IRAK-1 ODN (4μg) or antisense IRAK-2 ODN (4μg) for 8 h, maximum inhibition rates of 34.6%±0.9% and 54.5%±0.2%, respectively, were observed. Cotransfection of antisense IRAK-1 ODN with antisense IRAK-2 ODN resulted in an additive inhibition of NF-κB-activation by 77.5%±0.9%. ConclusionThese data suggest that either IRAK-1 or IRAK-2 is necessary but not sufficient to activate NF-κB and that IRAK-1 regulate IL-1-stimulated NF-κB activation in cooperation with IRAK-2.

【 Subject words 】Interleukin-1; Interleukin-1 receptor associated kinase; Antisense oligonucleotide; Nuclear factor-κB

白细胞介素-1（IL-1）是在免疫和炎症反应中起核心作用的细胞因子。越来越多的研究表明，IL-1的生物学效应主要由转录因子核因子-κB（NF-κB）调控^〔1〕。因此，阐明IL-1活化NF-κB的机制显得尤为重要。

IL-1刺激信号由其Ⅰ型受体（IL-1RⅠ）转导。与大多数细胞因子受体不同，IL-1RⅠ没有内在的蛋白激酶活性^〔2〕，因而势必需要结合细胞浆蛋白激酶来传导信号。IL-1受体相关激酶-1（IRAK-1）和IRAK-2就属于这样的蛋白激酶。研究表明，IRAK-1和IRAK-2都能通过下游的肿瘤坏死因子受体相关因子6 （TRAF6）激活NF-κB^〔3,4〕。但是，目前还不清楚它们是否协同作用，本文对此进行了探讨。

材料与方法

细胞系和试剂：HepG2细胞从ATCC公司购买，DMEM和lipofectin从Gibco BRL公司购买。IL-1β由北京邦定生物医学公司提供。山羊NF-κB p65亚基特异性抗体(抗原表位相应于人源NF-κB p65亚基羧基末端)和兔NF-κB p65亚基特异性抗体(抗原表位相应于人源NF-κB p65亚基氨基末端)由美国SantaCruZ生物技术公司生产。山羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG购自河南华美生物工程公司。SV总RNA分离试剂盒和逆转录-PCR(RT-PCR)试剂盒为Promega公司产品。

细胞培养^〔2〕：HepG2细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基于37℃，5% CO₂条件下培养至汇合成片。

寡核苷酸的序列及合成：反义IRAK-1寡核苷酸序列：5′-CCCCCCGGCCATGGCTGC-3′; 正义IRAK-1寡核苷酸序列: 5′-GCAGCCATGGCCGGGGGG-3′。反义IRAK-2寡核苷酸序列: 5′-GTAGATGTAGCAGGCCAT-3′; 正义IRAK-2寡核苷酸序列：5′-ATGGCCTGCTACATCTAC-3′。寡核苷酸由上海生工生物工程有限公司合成。寡核苷酸的5′端和3′端各3个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰。正义寡核苷酸序列与靶序列一致。反义寡核苷酸序列与靶序列互补。

Lipofectin包裹寡核苷酸的制备：参照lipofectin说明书操作。

RT-PCR测定IRAK-1 mRNA和IRAK-2 mRNA表达：汇合成片的细胞用IL-1β 100U/ml刺激30min，洗去IL-1β，IRAK-1实验组分别加入正义IRAK-1寡核苷酸4μg和反义IRAK-1寡核苷酸4μg；IRAK-2实验组分别加入正义IRAK-2寡核苷酸4μg和反义IRAK-2寡核苷酸4μg，各实验组均设立对照。细胞与寡核苷酸孵育8h，提取总RNA，RT-PCR扩增。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并用BIO-PROFIL/BIO-CAPT/BIO-1D⁺⁺图像分析软件（VILBER LOURMAT公司）定量。IRAK-1 5′端引物为：5′-ACTTCTTGTACGAGGTGCCGCC-3′; 3′端引物为：5′-GGGCAGGCCTGGGTCTGGCAGT-3′。IRAK-2 5′端引物为：5′-CTGAGGATGAACAGGAAGAGG-3′; 3′端引物为：5′-CCAGCACAGGTAA GACATTGG-3′。内参照β-actin 5′端引物为 5′-TGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′; 3′端引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′(由上海生工生物工程有限公司合成)。重复实验3次。

夹心ELISA法测定NF-κB：按Rovin等人^〔5〕的方法提取细胞核蛋白，用夹心ELISA法测定NF-κB。山羊NF-κB p65亚基特异性抗体3mg/L包被酶联板，每孔100μl，4℃过夜。PBS洗5次后加1% BSA(每孔100μl)，4℃封闭过夜。洗去未结合的BSA，加入经1∶500稀释的待测样品(每孔100μl)，37℃保温2h。洗去未结合的样品，每孔加100μl经1∶500稀释的兔NF-κB p65亚基特异性抗体，37℃保温2h。洗去未结合的抗体，每孔加100μl经1∶1000稀释的HRP标记抗体，37℃保温2h。洗去未结合的酶标抗体，加OPD 2mmol/L(含0.006% H₂O₂)(每孔100μl)，37℃保温1h。反应用柠檬酸2mol/L(每孔50μl)终止。测量450nm处的吸光度值。实验设立山羊NF-κB p65亚基特异性抗体和兔NF-κB p65亚基特异性抗体对照组以及BSA无关对照组。重复实验3次。

数据分析：实验数据以±s表示，采用t检验进行统计学分析。

结果

1.反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别对IRAK-1和IRAK-2表达的影响：以IRAK-1或IRAK-2 PCR产物与作为内参照的看家基因β-actin PCR产物吸收峰体积的比值反映反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸对各自的靶基因表达的影响。结果表明，反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1和IRAK-2表达（与对照组相比，P＜0.01），而正义IRAK-1寡核苷酸和正义IRAK-2寡核苷酸都不能抑制靶基因表达（图1A、B）。

2.反义IRAK-1寡核苷酸对NF-κB活化的影响：汇合成片的细胞用IL-1β 100U/ml刺激30min，洗去IL-1β，加入lipofectin包裹的反义IRAK-1寡核苷酸孵育一定时间，洗去反义寡核苷酸，IL-1β刺激1h。同时设立对照组（细胞接受IL-1刺激但不转染反义IRAK-1寡核苷酸）和基础组（细胞既不接受IL-1刺激也不转染反义IRAK-1寡核苷酸）。提取各组细胞核蛋白，检测NF-κB水平。结果表明，反义IRAK-1 寡核苷酸呈时间和剂量依赖性地抑制NF-κB活化(图2A)。4μg反义IRAK-1寡核苷酸与细胞孵育8h的抑制作用最强，NF-κB的吸光度(A)值从对照组的2.179±0.029降至1.422±0.029，抑制率为(34.6±0.9)%(图2B)。但是此时的NF-κB活性仍远高于基础NF-κB水平（NF-κB基础水平值为A=0.157±0.003，图2B)，说明反义IRAK-1寡核苷酸不能完全抑制NF-κB活化。上述结果意味着IRAK-1调控NF-κB的活化但不足以激活NF-κB。

3.反义IRAK-2寡核苷酸对NF-κB活化的影响：汇合成片的细胞用IL-1β 100U/ml 刺激30min，洗去IL-1β，加入lipofectin包裹的反义IRAK-2寡核苷酸孵育一定时间，洗去反义寡核苷酸，IL-1β刺激1h。同时设立对照组（细胞接受IL-1刺激但不转染反义IRAK-2寡核苷酸）和基础组（细胞既不接受IL-1刺激也不转染反义IRAK-2寡核苷酸）。提取各组细胞核蛋白，检测NF-κB水平。结果表明，反义IRAK-2寡核苷酸呈时间和剂量依赖性地抑制NF-κB活化(图3A)。当4μg反义IRAK-2寡核苷酸与HepG2细胞共孵育8h时，NF-κB的吸光度值降幅最大，从对照组的A=2.371±0.051下降到1.079±0.006，抑制率达(54.5±0.2)%（图3B）。然而，与反义IRAK-1寡核苷酸类似，反义IRAK-2寡核苷酸对NF-κB的抑制不完全（图3B）。预示虽然IRAK-2在IL-1诱导的NF-κB活化中起重要的调节作用，但IRAK-2只能部分激活