编者按：自本世纪70年代建立的单克隆抗体技术用于免疫学领域的研究，迄今已能鉴定约166种免疫细胞及其相关细胞表面分子，使免疫学的研究进入了分子免疫学时期。探讨这些免疫分子的结构和功能已提到了日程。

藉助分子生物学技术进行了相关基因克隆，并对其编码蛋白分子的氨基酸序列进行了分析，阐明了相关免疫分子的分子结构。但对这些特殊分子功能的研究，单纯的氨基酸序列分析尚不足以说明其在生命过程中的作用，只有应用遗传学方法，才能确定特定基因及其编码蛋白分子在细胞活动中的作用。

经典遗传学方法只能对简单有机体(如单细胞生物细菌与酵母；多细胞生物果蝇和蠕虫)进行生物学过程分析，但不适用于复杂有机体(哺乳类)的生物学分析。而分子遗传学方法则可用于复杂有机体生物学分析，用以研究这些大分子在个体发育、免疫系统及中枢神经系统的发生，以及生理与病理过程中的作用。因此只有应用转基因动物使相关基因通过表达、排除或突变，检测其在转基因动物体内对生理功能的影响，才能确定相关基因及其编码蛋白分子的生物学意义。

国内在兽医方面开展了一些转基因动物的研究工作，但很少涉及到免疫学的应用。本文概括的介绍了转基因小鼠技术的研究进展及其在免疫学研究中所取得的部分资料，反映了现代分子免疫学的研究水平，很有参考意义。

郭长占综述龙振洲审校

转基因动物是指用实验的方法将外源基因导入早期胚胎细胞，使之整合于细胞基因组中而建立的动物品系。最早建立成功的转基因动物是转基因小鼠(transgenic mice)。由于转基因小鼠的建立比其它大型转基因哺乳动物的建立要省时、省力，因此转基因小鼠作为生命科学研究的一个新体系已经得到越来越广泛的应用。

以往的转基因技术是将外源基因导入原核细胞或真核细胞来研究基因的表达调控与基因的功能。但基因在离体单个细胞中的功能并不一定能代表基因在整体中的功能。因为在一个复杂的动物个体中，众多的基因彼此之间在功能上并不是孤立的，而是相互关联、相互影响的。而且，一个基因在单一细胞中的表达究竟会对整个机体的生理功能产生什么作用也必须在整体水平来研究。从60年代开始，生命科学研究人员就试图找到一种恰当的方法，将特定的基因导入发育中的哺乳动物体内，以便研究基因的功能及调控规律。到70年代中期，几种将外源基因导入早期哺乳动物胚胎的方法逐步建立起来，从而为建立转基因小鼠奠定了基础。1982年，美国学者Palmiter^〔1〕将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵，所生7只子代小鼠中有6只生长加快，体重明显增加，这就是所谓的“超级小鼠”(supermouse)诞生了。“超级小鼠”的建立成功轰动了整个生命科学界，科学家们对此表现出浓厚的兴趣，许多实验室竞相开展这方面的研究工作，因此转基因小鼠技术迅速发展，不断完善。

一、转基因小鼠技术发展

转基因小鼠技术兴起于60年代，至80年代中期逐渐成熟。其中关键的技术是实现外源基因的导入及整合，这一技术的发展到目前已经历了四个阶段。

第一阶段：实现外源基因的导入。1974年，Jaenisch等^〔2〕用显微注射法将SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵中的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。这一阶段转基因技术的共同特点是导入的外源基因是随机整合的。这种随机整合的外源基因可能是单拷贝的，也可能是多拷贝的。外源基因整合的结果可能会有几种情况出现：①能够有效地表达，且不影响动物的发育以及正常的生理功能。②不能有效表达，整合入动物细胞基因组中的外源基因无功能。③外源基因的整合导致动物细胞正常基因的失活或激活癌基因，这样动物则不能正常发育、繁殖。

第二阶段：导入的外源基因与内源基因同源重组。 1987年，Utah大学Capecchi^〔3〕领导的研究小组根据同源重组的原理，实现了导入的外源基因的定点整合，这一技术亦称为“基因打靶”(gene targeting)。基因打靶技术的应用，一方面可以使导入的外源基因定点整合于人们希望整合的部位，从而避免了外源基因随机整合对内源基因的影响；另一方面，人们还可以利用基因打靶技术定点灭活一个内源基因，亦称为“基因敲除”(gene knockout)。因此，基因打靶技术为在整体水平研究某一基因的功能以及进行基因的修正，即基因治疗开辟了新的途径。

第三阶段：实现导入的外源基因组织特异性表达。 尽管基因打靶技术的应用实现了外源基因的定点整合，但整合入的外源基因要随着生殖细胞的发育进入各种组织细胞，这样外源基因的表达就没有组织特异性，因而无法研究某一基因在特定组织中的功能。随着一系列组织特异性启动子的发现和应用，导入的外源基因逐步实现了在特定组织细胞内的表达。表达的调控手段各异，如应用重金属元素、热休克蛋白和甾体激素等。这样就使得对转入的外源基因功能的研究更精确了^〔4〕。

第四阶段：导入的外源基因在动物发育阶段上的可控表达。外源基因如果不影响动物的胚胎发育，则携带有外源基因的动物可以生长，发育成熟，但有时导入的外源基因会影响动物的胚胎发育，导致动物在胚胎阶段死亡。为了克服这一弊端，必须要找到一种可以人为控制外源基因在特定发育阶段进行表达的方法。1993年，Gu等^〔5〕应用Cre/loxP重组酶系统实现了外源基因的时间特异性表达。现在已经能够从时间和空间的角度控制外源基因的表达并观察其功能。

二、转基因小鼠的制备原理与方法

(一)转基因小鼠制备的基本程序^〔6〕：(1)选择小鼠品系，可以用远交系也可以用近交系。(2)准备不育雄鼠和假孕母鼠。(3)收获受精卵。(4)将导入外源基因的受精卵植入假孕母鼠的输卵管或子宫内使之发育。(5)首建转基因鼠(founder)中外源基因整合的检测。(6)通过繁育建立转基因小鼠品系。其流程见图1。

图1转基因小鼠制备的一般实验流程

(二)外源基因导入方法：(1)显微注射法。(2)逆转录病毒载体法。(3)电脉冲法。

三、基因打靶技术在转基因小鼠制备中的应用

(一)基因打靶的原理： 基因打靶是根据同源重组的原理而设计的一项技术。在这一技术中，体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”，这样导入的外源基因进入受体细胞后就不再是随机整合，而是“弹头”锚准“靶子”进行准确的定点整合。如何使外源基因能定点整合于靶基因上呢根据DNA同源重组的原理，导入的外源基因必须和靶基因有一定的同源序列。因此，外源基因导入前必须经过精巧的构建，经构建的外源基因称为打靶载体(targeting vector)。基因打靶的结局有如下可能：(1)靶基因被灭活，即基因敲除，当打靶载体中插入一个特定的DNA序列就可以实现基因敲除。(2)靶基因被导入的外源基因替代，可以是以正常基因替代突变的基因。(3)在受体细胞基因组中定点引入一个原本不存在的完全新的基因，称之为基因击入(gene knockin)。

(二)基因打靶的方法：进行基因打靶要经历以下步骤：构建打靶载体、打靶载体导入受体细胞(常用胚胎干细胞，即ES细胞)、打靶ES细胞导入囊胚、囊胚植入假孕母鼠子宫发育^〔7〕。

1.打靶载体的构建： 基因打靶的关键在于构建打靶载体。在打靶载体中需要一个与靶基因同源的DNA片段，这一片段称为同源重组指导序列(homologous recombination directing sequences, HRDS)。外源基因插入这一同源序列之中。HRDS一般用基因组DNA而不用cDNA，因cDNA容易造成缺失或其它改变，长度可从3kb至15kb。依据打靶载体插入受体细胞基因组的方式不同，打靶载体可分为两种类型。一种称为O型载体，这种打靶载体在与靶基因发生同源重组时将全部插入到靶基因特定位点中，因此亦称插入型载体。插入型载体一般用于基因击入(gene knockin)和基因敲除(gene knockout)。另一种类型的打靶载体称为Ω型载体，这种打靶载体在与靶基因同源重组时HRDS之间外源基因将取代受体细胞基因组与HRDS同源序列之间的基因，因此，除可用于基因击入、基因敲除外，还可用于基因修正(gene repairment)。

2.外源基因导入靶细胞： 基因打靶所使用的受体细胞一般用胚胎干细胞(ES细胞)，ES细胞是一种多潜能的干细胞，能在体外传代而不改变其多潜能性。小鼠胚胎干细胞是从着床前胚胎的(孕3～5d)内细胞团(inner mass)分离的细胞。1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman首先分离培养成功。外源基因导入ES细胞的方法有电击法、逆转录病毒载体法、脂质体包装法以及磷酸钙沉淀法等。外源基因导入ES细胞与否，还需经过G418和GANC培养基筛选。由于同源重组的频率很低，因而筛选并富集真正发生了同源重组的细胞是至关重要的。筛选可采用正负选择法，其基本原理是：在构建打靶载体时，打靶载体含有一段与靶基因同源的序列，将新霉素抗性基因(neo^r)插入到该同源序列的第一个外显子中作为正选择标志；在同源